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本论文进行了纤维素酶系中内切β-葡聚糖苷酶(内切酶)的分离纯化及内切酶动力学研究。通过(NH4)2SO4盐析、Sephadex G100凝胶柱层析、DEAEFF弱阴离子交换柱层析(应用快速蛋白液相色谱系统FPLC)等分离纯化技术,从市购黑曲霉发酵粉和本实验室自行筛选的一株绿色木霉MJ1固体发酵产物中分离分别纯化出两种电泳纯内切酶。
从黑曲霉发酵粉中分离纯化出的内切酶的比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%,SDS-PAGE电泳后经凝胶成像系统分析分子量为26.4KD。最适反应温度是55℃,最适pH为4.8,动力学参数Km和Vmax分别为6.838×10-3g·mL-1、2.906×10-2mg·(mL·min)-1。
从绿色木霉MJ1固体发酵产物中分离纯化出的内切酶的比活力提高了28.6倍,回收率为19.7%,SDS-PAGE电泳后经凝胶成像系统分析分子量为64.7KD。最适反应温度为53℃,最适pH为4.2,Km和Vmax分别为1.230×10-2g·mL-1、2.396×10-2mg·(mL·min)-1。
向黑曲霉产电泳纯内切酶中加入葡萄糖,结果表明葡萄糖增加了内切酶的热稳定性。探讨了葡萄糖对酶活力的保护作用机制,建立了一个动力学模型,并进行了验证。热力学参数熵和焓值的降低也进一步证实了实验结论。
在一系列假设基础上提出绿色木霉MJ1产电泳纯内切酶水解CMC-Na的反应机理,建立了一个pH值对内切酶活力影响的动力学模型,推导出反应速率表达式。试验最佳初始pH值与模型计算pH值符合,从而模型得以验证。
向绿色木霉MJ1产内切酶液中分别添加葡萄糖、半乳糖、木糖、蔗糖、果糖等几种糖,结果表明:葡萄糖和半乳糖对内切酶具有竞争性抑制作用,而半乳糖的抑制作用更大;木糖对其产生非竞争性抑制;蔗糖起到了反竞争性抑制作用;D-果糖基本无影响。并讨论了葡萄糖、半乳糖、木糖和蔗糖对内切酶的作用机制。
用甲醇修饰绿色木霉产内切酶,结果表明:甲醇的修饰导致内切酶活力的显著降低,葡萄糖和底物降低了酶修饰的失活程度,由FTIR分析所修饰的侧链基团为羧基,动力学方法分析确认一个羧基为内切酶活性部位的必需基团。通过对FTIR原始光谱的酰胺Ⅰ带进行二阶导和曲线拟合得出修饰后内切酶二级结构的变化为:β-折叠和α-螺旋的含量均升高,而转角和无序结构含量降低。