研究背景随着科技进步和生活节奏的加快，人们面临各个方面的应激原，经常处于心理应激状态。适度的应激会对机体起到一定的保护作用，而过度的应激则会诱发心理、生理平衡的失调，从而诱发某些疾病，应激防护已成为当今研究的热点课题。课题组前期发现心理应激会导致机体部分脑区铁蓄积，而脑铁蓄积则会诱发细胞氧化应激损伤和诱导细胞死亡等。已有研究证明脑铁过多与多种中枢神经退行性病变密切相关，如帕金森氏病、阿尔茨海默病等。但目前为止，应激导致部分脑区铁蓄积的机制尚未完全阐明。机体的铁以两种形式存在，即无机铁和蛋白结合铁。蛋白结合铁包括铁蛋白结合铁、铁血黄素铁和含铁酶类等，其中主要是与血红素结合的铁。目前，无机铁的摄取和转运已基本清楚，但血红素的摄取还未完全明确。细胞除自身合成铁以外，是否可以通过增加血红素的摄取而增加细胞内铁含量还不完全清楚。但血红素过多对细胞是有潜在毒性的。据报道，出血性中风患者脑内游离的血红素会增多，血红素增多与中风后细胞氧化应激损伤甚至凋亡密切相关。Shayeghi等人认为小肠血红素铁的吸收主要是通过血红素转运蛋白HCP1来完成的，HCP1首先在肠道被发现的，在肝、肾、脑、及多种细胞上都有表达，最近有学者发现星型胶质细胞也有HCP1的表达，且证明星型胶质细胞HCP1具有摄取血红素铁的功能。有意义的是，我课题组前期基因芯片结果显示心理应激后大鼠肝脏血红素转运蛋白HCP1表达异常增高，心理应激大鼠脑内HCP1有何变化尚不清楚，应激大鼠部分脑区铁含量增加是否与HCP1表达有关尚无报道，本文为阐明此问题进行了研究。研究目的观察心理应激对大鼠部分脑区HCP1表达及相应脑区铁含量的影响，明确海马神经细胞HT-22是否可以通过HCP1摄取血红素铁。在此基础上探讨心理应激状态下HCP1表达变化机制。研究方法1.心理应激对大鼠部分脑区铁含量及血红素转运蛋白HCP1表达的影响1.1复制大鼠心理应激模型1.1.1实验动物分组雄性成年SD大鼠，体重120g左右。按体重随机分为空白对照组、心理应激组。动物饲养实验室环境温度24℃左右，湿度50%~60%；使用单笼饲养，自由饮食。1.1.2方法参照文献，复制大鼠心理应激模型。模型由透明树脂板隔成20个小室。一半区域底部绝缘，另一半区域底部通电，两个不同区域交叉设置。应激组大鼠放在绝缘区小室，电击组大鼠放在通电区，通电后被电击的大鼠惊叫，跳跃，使周围的应激组大鼠产生恐惧的心理反应。每天上午9点通电30min,电压80V左右，共7天。1.1.3心理应激大鼠血清皮质酮(CORT)水平检测按照放免试剂盒说明操作。1.2心理应激对大鼠部分脑区铁含量的影响称取海马、皮层、纹状体组织，用湿式消化法消化，样本用去离子水精确定容。采用空气-乙炔火焰原子吸收法测定样本中铁含量，根据标准曲线和组织重量得出相应的测定结果。单位组织内铁含量用ng/mg组织表示。1.3心理应激对大鼠部分脑区血红素转运蛋白HCP1表达的影响用Trizol试剂抽提大鼠海马、皮层、纹状体总RNA，采用实时定量荧光PCR(RT-PCR)法测定对照组与应激组大鼠海马、皮层、纹状体内HCP1mRNA表达水平。蛋白免疫印迹方法(Western blot)测定对照组与应激组大鼠海马、皮层内HCP1的含量。2. HT-22细胞HCP1转运血红素铁功能观察2.1不同浓度的血红素铁对海马神经细胞HT-22铁含量及细胞活性的影响细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。培养液中加入不同浓度的血红素铁（0μM、10μM、30μM、50μM）,孵育不同时间（2h、4h、6h）。用CCK-8试剂盒检测不同浓度血红素铁干预后细胞活性情况。细胞用NaOH裂解后用BCA法测细胞总蛋白，原子吸收分光光度计测量细胞内总铁含量。单位细胞内铁含量即细胞内总铁含量与蛋白含量的比值，用nmol/mg蛋白表示。2.2锌卟啉代替血红素铁进一步观察HT-22细胞HCP1的摄取血红素铁功能干预组细胞加入锌卟啉30μM，2小时后洗涤细胞，用甲醛固定30分钟后，加入抗荧光淬灭剂，后通过荧光显微镜观察细胞内锌卟啉自发荧光情况。3.应激状态引起大鼠部分脑区HCP1表达变化的机制研究3.1观察心理应激对大鼠部分脑区HCP1转录因子表达的影响研究发现KLF4、NRF1、YY1、CDX2等转录因子可以调控肠细胞HCP1的表达，但心理应激状态下,这些转录因子在脑区是否起作用不清楚。所以本实验首先查看心理应激大鼠部分脑区HCP1转录因子的表达的变化。用Trizol试剂抽提大鼠海马、皮层总RNA，采用实时定量荧光PCR法测定大鼠应激后相应组织内KLF4、NRF1、YY1、CDX2转录因子mRNA表达水平。Western blot法测定对照组与应激组大鼠海马、皮层内KLF4蛋白的含量。3.2皮质酮是否通过KLF4影响HCP1的表达3.2.1皮质酮对HT-22细胞HCP1表达的影响细胞分对照组和干预组。干预组细胞加入不同浓度的皮质酮（0μM、1μM、10μM、15μM、30μM）孵育36h。用CCK-8试剂盒检测皮质酮干预后细胞活性。采用实时定量荧光PCR法测定经皮质酮干预后细胞内HCP1mRNA表达水平。Western blot法测定皮质酮干预后细胞内HCP1蛋白含量的变化。终浓度30μM的的皮质酮对HT-22细胞活性无明显影响，选定30μM皮质酮孵育不同时间（0~36h），同样的方法检测细胞内HCP1mRNA及蛋白含量。3.2.2皮质酮对HT-22细胞KLF4表达的影响干预组细胞加入皮质酮30μM，孵育不同时间（0~24h）。Western blot法测定细胞内KLF4蛋白含量的变化。3.2.3干扰KLF4后，皮质酮对HT-22细胞HCP1表达的影响由吉玛公司设计并合成三条KLF4干扰RNA（siRNA）即901、1331、1796和FAM空白对照组序列,分别转染至HT-22细胞,转染48小时后提取细胞RNA，用PCR法检测细胞内对照组和转染组KLF4mRNA的水平，结果序列1331组KLF4mRNA下降至对照组的10%左右，效果最好。于是将1331序列用同样的方法转染至细胞内，24小时后对照组、干预组均加入皮质酮30μM继续孵育。采用实时定量荧光PCR法测定细胞内HCP1mRNA表达水平。Western blot法测定细胞内HCP1蛋白含量的变化。3.2.4阻断糖皮质激素受体后，皮质酮对HT-22细胞HCP1表达的影响HT-22细胞用终浓度10μM RU486孵育，1h后加入皮质酮30μM继续孵育24h，Western blot法测定细胞内HCP1蛋白含量的变化。3.3皮质酮是否通过KLF4影响HT-22细胞内铁含量3.3.1皮质酮对HT-22细胞内铁含量的影响a细胞培养同上，干预组细胞经30μM皮质酮孵育24h后，干预组、对照组均加入30μM血红素铁，继续孵育0.5h/1h/2h，然后用NaOH溶液裂解细胞后，BCA法测细胞内总蛋白，空气-乙炔火焰原子吸收分光光度计测细胞内总铁含量。b锌卟啉代替血红素铁进一步观察皮质酮对HT-22细胞内铁含量的影响细胞培养同上，干预组细胞经30μM皮质酮孵育24h后，干预组、对照组均加入30μM锌卟啉，继续孵育2h，干预完毕用4%的多聚甲醛固定，在荧光显微镜下观察细胞内锌卟啉的自发荧光情况。3.3.2干扰KLF4后，皮质酮对HT-22细胞内铁含量的影响细胞培养同上， KLF4干扰效果最好的序列1331转染入干预组细胞，孵育24小时后，对照组、干预组均加入皮质酮30μM，继续孵育24小时后，干预组、对照组均加入30μM血红素铁，继续孵育0.5h/1h/2h，然后用NaOH溶液裂解细胞后，BCA法测细胞内总蛋白，原子吸收法测细胞内总铁含量。细胞内铁含量即细胞总铁含量与细胞蛋白含量的比值，用nmol/mg蛋白表示。4.数据的统计与处理western条带采用quantity one图像分析系统进行灰度分析。两组间差异采用成组设计资料的t检验方法，多组间差异采用One-wayANOVA即单因素方差分析。P <0.05表示差别有统计学意义，P<0.01表示非常显著性差异。P<0.001表示极其显著差异。结果1.心理应激对大鼠部分脑区铁含量及HCP1表达的影响1.1应激组大鼠血清皮质酮水平变化与对照组相比，应激组大鼠体内皮质酮含量明显升高（P <0.01）。1.2心理应激对大鼠部分脑区铁含量的影响与对照组相比，应激组大鼠海马、皮层、纹状体内铁含量均有显著升高（P<0.05）。1.3心理应激对大鼠部分脑区HCP1表达的影响实时定量荧光PCR结果显示应激组大鼠海马、皮层、纹状体内HCP1mRNA表达水平比对照组明显升高。海马内HCP1mRNA表达水平升高大概3倍（P <0.001）、皮层内升高约7倍（P <0.001）；Western blot结果显示心理应激组大鼠海马、皮层内HCP1蛋白含量显著升高。2.海马神经细胞HT-22HCP1转运血红素铁功能观察与对照组相比，HT-22细胞内总铁含量随血红素铁浓度增大和时间的延长而增加（P <0.01）。荧光显微镜图片显示细胞经锌卟啉孵育后，细胞内有明显的锌卟啉聚集。3.应激状态引起HCP1表达变化的机制探讨3.1心理应激对HCP1的转录因子表达的影响实时定量荧光PCR结果显示应激大鼠海马、皮层内KLF4mRNA显著增高（P<0.01）；Western blot显示应激组大鼠海马、皮层内KLF4蛋白的含量较对照组比较明显增高（P <0.01）。其他相关转录因子的变化无统计学差异（P>0.05）。3.2皮质酮是否通过KLF4影响HCP1的表达3.2.1经30μM皮质酮孵育后，细胞活性无明显变化，细胞内HCP1mRNA表达水平随皮质酮浓度的增大和时间的延长而明显增加（P <0.01）；HCP1蛋白含量在8h后明显增加（P <0.05）。3.2.2皮质酮干预不同时间后，细胞内KLF4蛋白水平从2h后显著增高（P<0.05）。3.2.3用siRNA干扰KLF4后，皮质酮对HT-22细胞HCP1的上调作用被取消（P>0.05）。3.2.4阻断糖皮质激素受体后，皮质酮对HT-22细胞HCP1表达无明显影响（P>0.05）。3.3皮质酮是否通过KLF4影响细胞内铁含量细胞经皮质酮孵育后，细胞内总铁含量呈上升趋势（P <0.05）。干扰KLF4后，皮质酮对HT-22细胞内铁含量影响无明显影响（P>0.05）。结论1.应激组大鼠皮质酮水平明显升高，说明大鼠心理应激模型复制成功。应激组大鼠海马、皮层、纹状体内出现明显的铁蓄积并伴有血红素转运蛋白HCP1的高表达，提示应激大鼠脑铁蓄积可能与HCP1有关；2. HT-22细胞内总铁含量随着血红素铁浓度及孵育时间的延长呈增加趋势，结合荧光显微镜图片显示，可以确定HT-22细胞HCP1有摄取血红素铁功能，提示细胞可以通过摄取血红素铁而增加细胞内铁含量。3.动物实验发现应激组大鼠海马、皮层内HCP1的转录因子KLF4表达明显升高，其他转录因子无明显变化。细胞实验证实皮质酮对HT-22细胞HCP1及KLF4的表达有上调作用，且皮质酮可以增加HT-22细胞内铁含量。干扰KLF4后，皮质酮对HT-22细胞HCP1的上调作用被取消，细胞内铁的含量也无明显变化，提示皮质酮可以通过KLF4影响HT-22细胞HCP1表达及细胞内铁含量。综合上述实验结果，我们推测大鼠心理应激后部分脑区铁蓄积，可能是由于应激时大鼠皮质酮分泌的增加上调了KLF4的表达，从而HCP1表达升高，使脑内血红素铁摄入增多，最终导致大鼠部分脑区铁蓄积。