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研究背景:阴茎硬结症(Peyronie’s Disease,PD)是目前男性的常见病之一,其发病机制尚不完全清楚。临床上仍没有明显有效的药物来治疗PD,现如今主要采取手术治疗。据最新文献报道研究,Kindlin-2参与的TGF-β1/Smad3信号反应通路对于加速肾脏的纤维化发挥着重要作用,但有关Kindlin-2在PD中的作用尚无报道。研究目的:本课题通过观察PD成纤维细胞的增殖能力及检测相关的因子表达变化情况,来探究Kindlin-2介导的TGF-β1/Smad3信号通路在阴茎硬结症发生发展中的作用机制,为有效防治PD发生、发展及治疗提供新的研究思路。研究方法:1.通过检测siRNA沉默PD成纤维细胞后,细胞内表达Kindlin-2基因的能力。我们把常规养殖的PD成纤维细胞随机分为3组:空白对照组(normal)、阴性对照组(NC)和小干扰RNA组(Kindlin-2-siRNA),经过siRNA转染的PD成纤维细胞48 h后,利用RT-PCR技术检测3组细胞内Kindlin-2的mRNA发挥程度。2.将常规标准下养殖的PD成纤维细胞随机分成四组:(1)空白对照组(normal):常规培养细胞;(2)TGF-β1组(TGF-β1):将PD成纤维细胞用PBS缓冲溶液冲刷2次后,放进5ng/ml TGF-β1浓度的DMEM完全培养基,常规标准下养殖30min;(3)沉默Kindlin-2组(Kindlin-2-siRNA):将细胞用PBS缓冲液冲洗2遍后,用siRNA转染PD成纤维细胞48h,沉默细胞内Kindlin-2的表达;(4)沉默Kindlin-2+TGF-β1组(Kindlin-2-siRNA+TGF-β1):Kindlin-2-siRNA转染PD成纤维细胞48h,加入5ng/ml TGF-β1浓度的DMEM完全培养基,常规培养30min。(1)RT-PCR及Western blot检测4组PD成纤维细胞中p-Smad3的转录及表达水平。(2)通过RT-PCR检测实验中PD成纤维细胞Kindlin-2、PARP-1、Cyclin-D1和MMP-9的转录水平。(3)通过Western blot检测实验中PD成纤维细胞Kindlin-2、PARP-1、Cyclin-D1和MMP-9的蛋白水平。(4)CCK8实验方式分别检测PD成纤维细胞在450nm处所测得的OD值,绘制各组的细胞发展曲线,然后应用t检验计算各时间点实验组与对照组结果是否具有统计学意义。研究结果:1.经t检验分析后,空白对照组和阴性对照组之间Kindlin-2mRNA的数据无统计学意义;沉默Kindlin-2组分别与空白对照组的数据进行t检验分析,有统计学意义。2.在细胞培养基内加入TGF-β1可显著提高Smad3的磷酸化水平;通过siRNA沉默细胞内Kindlin-2的发挥后,PD成纤维细胞内的Smad3的磷酸化水平显著降低,再向细胞培养基内加入TGF-β1亦不能提高Smad3的磷酸化水平。3.在完全培养基内加入TGF-β1培养PD成纤维细胞后,可提高细胞内纤维化相关因子(PARP-1、Cyclin-D1和MMP-9)的表达水平,siRNA沉默Kindlin-2后可显著抑制相关因子的表达,且在沉默Kindlin-2和TGF-β1同时作用下细胞内相关因子的表达仍为抑制状态。4.TGF-β1可显著提高PD成纤维细胞的增殖能力,沉默Kindlin-2后细胞的增殖能力显著降低,在沉默Kindlin-2和TGF-β1同时作用下细胞的增殖能力仍为降低状态。结论:Kindlin-2不能直接激活Smad3促进细胞纤维化,Kindlin-2与TGF-β1具有协同作用激活Smad3,且TGF-β1引起Smad3的磷酸化需要Kindlin-2的参与。下调Kindlin-2基因的发挥可有效降低PD成纤维细胞的增殖能力。TGF-β1可上调PD成纤维细胞内纤维化相关因子的表达和增加细胞增殖能力,但需要Kindlin-2的参与。