低温限制着植物的生长发育和地理分布,在全世界,每年因低温伤害造成的农作物损失高达数千亿美元,因此,对植物抗寒调控机制和抗寒育种的研究有着极为迫切的现实需求。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)作为重要的油料作物在全球范围内广泛种植,对低温环境具有较强的耐受性,蕴藏着丰富的抗寒基因。本研究以抗寒性较强的甘蓝型冬油菜L9为实验材料,分别在4℃条件下取胁迫0 h、2 h、6 h、12 h和24 h五个点取样,通过生理生化分析、切片观察、转录组测序分析和蛋白组测序分析,从RNA和蛋白质水平研究甘蓝型油菜叶片对低温胁迫的响应机制,结果总结如下:1.甘蓝型油菜响应低温胁迫的生理生化变化在4℃低温胁迫下,油菜叶片形态发生轻微变化,进一步的生理生化研究发现,耐寒品系L9比敏感品系L7响应低温胁迫更迅速,耐寒性更强。脯氨酸含量、可溶性糖含量、L7叶片电导率、L9叶绿素a、b含量随胁迫处理时间的延长含量上升,而L9叶片电导率和L7叶绿素a、b含量随胁迫处理时间的延长含量下降。透射电镜观察更进一步发现,在低温诱导下,叶绿体基粒片层结构逐步弥散,线粒体数目显著增加,这些细胞学指标可以为抗寒性鉴定提供参考。2.甘蓝型油菜低温诱导的转录组分析通过高通量测序及生物信息学分析,从4℃低温胁迫0 h、2 h、6 h、12 h和24h下的甘蓝型油菜叶片转录本中组装出71280-90041个unigene,其中不同集群的有31789-38201个,不同singletons的有39491-51840个,平均读长492 bp,可归类到25个COG分类中。比较不同的处理,发现低温胁迫12 h后有18641个(8499上调,10142个下调)基因表现差异,数量最多,其次是24 h(17824个)、6 h(7901个)、2 h(3198个)。差异基因聚类分析后得到13个类群,依据表达趋势划分为3大类。并且发现了大量和生物调控、免疫过程、代谢过程和应激响应等相关的差异功能基因,这些基因多数显著富集在植物昼夜节律、植物-病原菌互作、植物激素信号转导及次生代谢物生物合成等通路中。3.ap2/erf转录因子响应低温胁迫的动态调控对甘蓝型油菜4℃低温胁迫2h、6h、12h及24h下的全基因组转录本进行比对分析,鉴定出132个ap2/erf转录因子,经聚类分析结果表明,这些转录因子可聚为4个亚族13个亚组,其中dreb亚族和erf亚族聚有114个基因,未发现有基因聚到soloist亚族和dreba3亚组。经染色体定位分析,有118个基因非均匀地分布在a1-c9染色体上,其中a9和c7分布最多,a5和c4分布最少。go功能分析发现这些基因参与增强植物抗寒性的多种分子功能途径中,在不同低温胁迫阶段,ap2/erf亚族之间表现一种动态调控,rav亚族和dreb亚族响应低温胁迫比较迅速,ap2亚族后期才逐渐对低温胁迫进行响应;erf亚族和dreb亚族是参与低温调控的两个主要亚族,rav亚族通过正调控在植物抗寒过程中发挥作用。将4个胁迫阶段均出现差异表达的13个ap2/erf转录因子进行定量pcr验证,表明差异表达趋势与转录组数据结果一致。4.甘蓝型油菜低温诱导的蛋白组分析通过itraq测序分析,从4℃低温胁迫0h、2h、6h、12h和24h下的甘蓝型油菜叶片肽段图谱中,鉴定到3148个蛋白质,肽链长度主要分布在8-13aa之间。经过go功能注释和通路分析,鉴定到的蛋白质被注释到53条go条目和123条通路中。两两比较不同处理发现,在低温胁迫24h的情况下差异蛋白质最多,在572个蛋白质中有320个表现上调,252个表现下调。通路富集分析表明,低温胁迫2h后,显著富集的通路包括光合天线蛋白和类胡萝卜素生物合成途径;6h后显著富集在赖氨酸、光合天线蛋白、氨基丙酸和组氨酸等4个途径中;在12h后显著富集在光合天线蛋白、光合作用、吞噬体和乙醛酸盐-羧酸盐新陈代谢等4个途径中;在24h后则显著富集在光合天线蛋白、甘油磷脂新陈代谢和植物-病原菌互作3个途径中。5.低温诱导的转录组和蛋白组关联分析将本实验中的转录组和蛋白组差异表达基因进行关联分析发现,低温胁迫的所有阶段中,具有相同趋势的可关联差异基因有177个,可注释在40条go条目中,并在不同的阶段,表现一种动态变化。在分子功能中,主要为催化活性和结合通路;在生物过程中,主要为代谢过程和细胞生理过程,在刺激应答通路也注释了较多的关联基因。这些具有相同趋势的关联差异基因在次生物质代谢、激素信号通路、植物-病原菌互作等通路明显富集。对低温诱导的甘蓝型油菜叶片转录组和蛋白组表达趋势相反的差异基因进行GO功能分类,发现可关联差异基因有135个,被注释在37条GO条目中,并在不同的阶段,也表现动态变化,且注释GO条目、通路富集结果与相同趋势关联基因分析结果相同。