【摘 要】
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隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是由隐孢子虫(Cryptosporidium)引起的一种世界性的人兽共患原虫病。该病对人类健康和动物生产带来严重危害,主要造成婴幼儿及免疫功能低下者致
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隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是由隐孢子虫(Cryptosporidium)引起的一种世界性的人兽共患原虫病。该病对人类健康和动物生产带来严重危害,主要造成婴幼儿及免疫功能低下者致死性肠炎,是人类爱滋病患者死亡的直接原因之一;动物多发于幼龄,主要表现为顽固性下痢,即使康复亦常复发,使生长受阻,造成很大的经济损失。近年来,国内外关于隐孢子虫研究的报道逐渐增多,烟台地区关于此病的研究较少。
本研究根据GenBank中已发表的隐孢子虫18srRNA基因设计一对引物,以从卵囊中提取的DNA为模板,对18srRNA基因进行PCR扩增,按常规方法与载体连接,经蓝白斑筛选和PCR鉴定获得阳性重组质粒,分别绘制质粒DNA和奶牛隐孢子虫卵囊的标准曲线,建立检测奶牛隐孢子虫18sRNA的SYBRGreenⅠreal-timePCR,并验证real-timePCR方法的特异性、敏感性和重复性;在real-timePCR检测隐孢子虫方法建立的基础上,对采自烟台地区6个奶牛场共565头奶牛的新鲜粪便进行流行病学调查,分析奶牛隐孢子虫感染与腹泻、季节、年龄等方面的相关性;从阳性样本中分离虫株,对分离株18srRNA基因进行序列分析,绘制进化树,分析分子种系发育关系,进而鉴定分离株的基因型。
试验结果表明:本研究建立的real-timePCR方法敏感性高、特异性强、重复性良好,最低检测阈为10个拷贝的质粒DNA和1g粪便中的10个卵囊,重复性试验的标准差为0.494;6个奶牛场的隐孢子虫感染率分别为12.75%、9.18%、10.67%、15.11%、11.11%和5.26%,总阳性率为10.44%,隐孢子虫感染主要来自于有腹泻症状的犊牛和青年牛,并以冬季和春季为多发季节;对分离到的YT1-6和YT7-16两类隐孢子虫的18sRNA基因测序结果表明该两类虫株卵囊序列与GenBank上的C.andersoni(AF093496)和C.parvum(AF108863)“mouser”型18srRNA基因核苷酸序列同源性分别为98.8%和98.4%,因而可以判断烟台地区感染的隐孢子虫为C.andersoni和C.parvummouse基因型。
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