近年来,随着人们生活水平的提高,军团病的发病率有着明显的上升趋势。1976年美国首次爆发“军团病”以来,已经有多个国家有军团病的报道。我国1982年在南京首次证实军团病病例。军团菌主要生长在各种有水的环境中,尤其在空调系统、供水系统中较为常见。我国多个城市对空调冷却塔进行军团菌调查发现其中军团菌的阳性率为50%-80%。空调冷却塔水军团菌污染对于人类健康存在潜在的威胁。目前我国军团菌的检测依然以细菌分离培养法为主,培养周期较长,不利于军团病的预防和控制。本课题对南方某城市中央空调冷却塔水军团菌污染状况作了相关调查与分析,同时对分离的菌株进行了分子分型研究,建立了分子流行病学资料。另外,本课题还初步建立了光纤倏逝波生物传感器快速检测1型嗜肺军团菌的方法,为大样本量Lpl污染严重水样的现场快速筛查提供了一个新的方向。研究目的1.对南方某城市酒店和宾馆、商场和超市、医院、写字楼等公共场所的空调冷却塔水进行军团菌的分离培养,了解军团菌的污染状况。初步了解空调冷却水军团菌污染状况与水温、细菌总数、空调使用年限、空调冷却塔水消毒情况等因素之间是否存在一定联系。2.用SBT分型技术对常规分离培养出的嗜肺军团菌菌株进行分子生物学分型,分析分离菌株的多态性,确定菌株的遗传基础之间相互的联系和变异,了解该城市军团菌分布流行病学特征。3.利用光纤倏逝波生物传感器适合现场快速检测的优势,初步建立1型嗜肺军团菌的快速检测平台。对该方法的检测条件进行优化,并在最佳检测条件下确定检测的灵敏度和特异性,并对人工感染样品进行检测,同时用传统方法进行计数,确认该方法的可行性。研究内容与方法1.采用平皿计数法对中央空调冷却塔水进行军团菌的分离培养,用血清学方法对分离菌株进行初步鉴定。检测冷却塔水水温、细菌总数,调查空调冷却塔的使用年限及消毒情况,分析其与军团菌检出之间是否存在一定联系。2.采用SBT基因分型技术(按照EWGLI标准)对所分离菌株进行分子分型。提取菌株基因组DNA,测定DNA在260nm,280nm处的吸光度值,计算DNA浓度。分别扩增7个管家基因(flaA、pile、asd、mip、momps、proA、neuA)的内部核酸序列片段,从394-710bp。获得的PCR扩增产物均进行纯化,并对纯化后产物测序。将测序结果上传至EWGLI数据库比对,得到菌株的等位基因图谱,确定分离菌株的序列分型。菌株ST分型结果利用MEGA4软件,按UPGMA绘制进化树,得到菌株的树形聚类图,观察菌株之间的相似度,分析菌株的亲缘关系。3.研究光纤倏逝波生物传感器快速检测1型嗜肺军团菌的方法,根据双抗体夹心免疫反应原理建立了Lp1的检测平台。利用Alexa Fluor 647荧光染料标记检测抗体,标记后的抗体分装后-20℃避光保存备用。将光纤用异丙醇清洗后用链霉亲和素包被,生物素标记的捕获抗体与链霉亲和素作用后发生亲和素-生物素放大反应,更有效地将捕获抗体连接到光纤上。在此基础上,对检测的最佳条件进行了优化,包括：捕获抗体与目标物的最佳反应时间,反应体系与检测抗体的最佳反应时间,捕获抗体的最佳浓度,检测抗体的最佳浓度等。在最佳检测条件下,确定检测Lp1的灵敏度和特异性,同时通过检测人工感染样品确认该方法检测实际样本的灵敏度和特异性,初步建立了Lp1快速检测方法。研究结果1.22户公共场所中有19户检出军团菌,阳性率高达86.4%；54份空调冷却塔的水样中有31份检出军团菌,总检出率为57.4%。不同类型场所采集的水样军团菌检出率无统计学意义(P>0.05)。检出的菌株均为嗜肺军团菌,其中Lp1型占35.5%,Lp2-14型占64.5%。不同冷却塔水温、水样菌落总数、空调使用年限、水样消毒与否对军团菌检出率影响均不显著(P>0.05)。2.采用SBT基因分型技术对分离的嗜肺军团菌进行分子分型,31株分离的嗜肺军团菌共得到19种SBT分型。其中11株Lp1共有分为5种ST型别,分别为ST1、ST159、ST160、ST154、ST52。其中ST1型5株,占45.5%,ST159型2株,其他ST型别各1株。20株Lp2-14共分为14种ST型别,其中数据库已知型别为ST242、ST152、ST8、ST367、ST560五种,其中ST242有5株占30%,还有a～f五种新ST型别各一株,Oa、Ob、Oc型别只扩增出6种基因,其中Oa有3株,Ob和Oc各1株。3.应用MEGA4软件对菌株的ST分型按UPGMA绘制进化树。对7个基因均扩增出的26株分离株遗传聚类分析结果显示可以将其分为两个同源谱系。其中2株ST159型、1株ST54型、1株ST160型及1株未知型别e属于一个同源系,提示有一定的亲缘关系；余下的序列型归属于另一个同源系。另外,结果还揭示了对于嗜肺军团菌来说,不同血清型菌株也有可能起源于同一个遗传祖先,具有相同ST型别的菌株也可能有不同的起源。4.光纤倏逝波生物传感器可以在40min之内自动完成检测。捕获抗体与目标物最佳反应时间、反应体系与检测抗体的最佳反应时间均为l0min,捕获抗体最佳使用浓度是100μg/ml,检测抗体最佳使用浓度为20μg/ml。在此条件下得到该方法检测Lpl的灵敏度为1.8×103cfu/ml。同时该方法对于Lpl检测的特异性强,13株其他血清型嗜肺军团菌,2株非嗜肺军团菌及4株非军团菌检测结果均为阴性。本实验通过对环境分离的31株菌制备的模拟样品的检测确认了该方法检测实际样本的灵敏度和特异性。检测结果显示样品中Lpl菌浓度在1.8×103cfu/ml以上时阳性率为100%；低于灵敏度,但浓度接近于1.8×103cfu/ml时,一份样品的3次检测中可能有1-2次结果为阳性。另外,Lp2-14型菌液模拟样品的检测结果均为阴性。研究结论本研究在南方某城市公共场所内获得了中央空调冷却塔水中军团菌的现场流行病学资料,为比较研究提供了可靠数据。同时对分离的嗜肺军团菌进行了SBT分型,有利于了解菌株的多态性及其遗传基础之间相互的联系和变异,为制订该城市军团菌的监测防治措施和控制军团病爆发流行提供科学依据。另外,本课题还初步建立了光纤倏逝波生物传感器快速检测1型嗜肺军团菌的方法,为大样本量Lpl污染严重水样的现场快速筛查提供一种新途径。