第一章circ₇22在红水河流域长寿人群的表达水平背景:衰老是由遗传及体内外环境等诸多因素相互作用引起的生理学变化过程,是生物界普遍存在的一种自然现象,其机制和分子遗传基础尚未明了。有报道发现hsa_circ₀000722（下文简称circ₇22）在老年人血清中表达上调并与冠心病的发病密切相关,但其在衰老进程中的作用尚未见报道。目的:研究circ₇22血清表达水平与衰老和长寿的关系。方法:以红水河流域年龄大于等于85岁的长寿组样本（n=132,93.25±3.09岁）为研究对象,以当地65-84的老年组（n=67,平均年龄为75.25±4.02岁）和小于65岁的年轻组（n=138,平均年龄为49.20±8.94）为对照,采集各组人群的外周血,分离血清,检测总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血压等临床指标。提取血清总RNA,利用RT-qPCR技术检测circ₇22在血清中的表达水平。circ₇22在不同分组中的表达水平用秩和检验进行统计分析,circ₇22表达水平与各临床指标的相关关系用Spearman相关分析。结果:（1）按年龄分组比较血清circ₇22表达水平,长寿组比老年组低[0.73（1.02）vs 1.13（1.57）],也比年轻组低[0.73（1.02）vs 0.85（1.27）],差异均存在统计学意义（P<0.05）;老年组比年轻组高[1.13（1.57）vs 0.85（1.27）],但差异尚无统计学意义;（2）按性别分组比较血清circ₇22表达水平,老年组男性表达水平最高,与长寿组[1.51（2.00）vs 0.74（1.42）]和年轻组[1.51（2.00）vs 0.74（1.16）]的差异均存在统计学意义（P<0.05）;长寿组女性比年轻组低[0.73（0.99）vs 1.06（1.37）],差异有统计学意义（P<0.05）;（3）circ₇22表达水平与甘油三脂呈负相关（r=-0.1142,P=0.0470）、与高密度脂蛋白呈正相关（r=0.1583,P=0.0058）、与空腹血糖呈正相关（r=0.1390,P=0.0142）。结论:circ₇22在红水河流域长寿人群中呈低表达,该长寿人群可能因为circ₇22的降低,减少了心血管病的风险而体现一定的生存优势。第二章circ₇22表达水平改变的分子遗传机制背景:circRNA由RNA反向剪切产生,有多种形成的形式,其中内含子配对驱动的环化形式较为常见,该环化形式常由其两侧翼Alu元件驱动。目的:探讨circ₇22侧翼Alu元件多态性与长寿和年龄相关性疾病的关系以及对circ₇22表达水平的影响。方法:（1）提取红水河流域长寿组、老年组、年轻组外周血白细胞基因组DNA（样本来源同第一章）,用PCR-Sanger测序法检测circ₇22侧翼Alu元件的SNPs位点,利用卡方检验分析各SNPs基因型、等位基因和单倍型在三组中组成;（2）用秩和检验分析SNPs位点与circ₇22表达水平和多个心脑血管危险因素的关系;（3）采集原发性高血压患者血样（n=99,60.32±5.81岁）,以同龄健康体检人群为对照（n=172,59.98±6.01岁）,检测Alu7元件SNPs位点,利用卡方检验分析各SNPs基因型、等位基因和单倍型在高血压中的分布情况;（4）采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除293T细胞的Alu7,利用RT-qPCR法检测circ₇22表达水平。结果:（1）circ₇22两侧翼共有7个Alu元件,小样本检测（n=40）未发现Alu1-6的SNPs位点;Alu7存在6个SNPs位点,分别为rs35297506,rs6539973,rs6539974,rs8056654,rs8056655,rs113042029;（2）Alu7的6个SNPs位点在红水河流域人群和高血压人群中均符合Hardy-Weinberg定律;（3）Alu7 rs6539973位点的基因型和等位基因频率在长寿组与非长寿组中的差异存在统计学意义（P<0.008）;（4）Alu7 rs8056654位点的基因型和等位基因频率在原发性高血压组和健康对照组中的差异具有统计学意义（P<0.008）;（5）Alu7多个SNPs不同基因型的个体血清cric₇22表达水平和多项血脂指标的差异存在统计学意义（P<0.05）;（6）在293T细胞中敲除Alu7元件后,circ₇22表达水平大幅度降低（0.96±0.12 vs 0.03±0.01,P<0.05）。结论:circ₇22侧翼Alu7元件的SNPs能影响circ₇22的表达水平且在长寿和高血压患者中存在作用,可能是长寿以及年龄相关性疾病发病的分子遗传基础。第三章circ₇22对细胞生物学功能的影响背景:机体在衰老的过程中,往往会发生疾病,包括神经退行性病变、糖尿病、心脑血管系统性疾病等,研究发现circRNA在这些疾病的发生发展中起着重要作用。本研究发现cric₇22在长寿人群中呈低表达,且与血脂水平相关。我们还发现cric₇22表达水平可能受其侧翼Alu7元件SNPs影响,而Alu7元件SNPs在长寿人群以及高血压患者中的分布均与对照人群存在差异,且与多个血脂指标的水平有关,因此我们推测circ₇22可能在心脑血管疾病的发病中存在作用。目的:探讨circ₇22在血管内皮细胞中的功能和潜在作用机制。方法:（1）利用慢病毒转染技术在人脐静脉内皮细胞株EA.hy926细胞中分别过表达和沉默circ₇22,以感染空载病毒和不感染慢病毒的EA.hy926细胞为对照,分别检测细胞增殖、周期、迁移、凋亡等功能和衰老相关指标的改变;（2）利用荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）技术检测circ₇22在EA.hy926细胞中的定位,推测其潜在的分子机制。结果:（1）过表达和沉默circ₇22均未改变EA.hy926细胞的增殖能力;（2）过表达和沉默circ₇22均未影响EA.hy926的细胞周期;（3）过表达circ₇22能增加EA.hy926细胞早期和晚期凋亡;沉默circ₇22对EA.hy926细胞凋亡未产生影响;（4）过表达circ₇22能提高EA.hy92细胞的迁移能力;沉默circ₇22则导致EA.hy92细胞的迁移能力下降;（5）过表达circ₇22会增加衰老细胞率和丙二醇（MDA）的含量,而不影响过氧化物歧化酶（SOD）的活性;（6）FISH实验显示circ₇22主要定位于细胞质。结论:circ₇22表达水平上调能促进人脐静脉内皮细胞株EA.hy926细胞的凋亡和衰老,可能是通过ceRNA（competing endogenous RNAs）的作用机制而发挥作用。第四章circ₇22-miRNA-mRNA调控网络的构建背景:高通量测序技术能够使研究者快速获取细胞整体转录水平的信息,从而加深对分子机制的认识。circ₇22能对脐静脉血管内皮细胞的功能产生影响,但其作用机制尚未明了。利用FISH技术检测发现circ₇22在细胞中主要定位于细胞质,推测其可能存在ceRNA的作用机制。敲除Alu7元件后能大幅度下调293T细胞circ₇22的表达水平（下调约30倍）,是研究circ₇22分子机制较好的细胞模型。目的:探讨circ₇22作用的分子机制。方法:（1）以野生型293T细胞为对照,用RNA-seq技术检测敲除Alu7元件下调circ₇22表达后细胞转录水平的改变;（2）利用生物信息学预测circ₇22结合的miRNA和这些miRNA靶向结合的mRNA,以了解circ₇22潜在调控的基因;（3）敲除Alu7下调circ₇22后,表达水平下调的mRNA与circ₇22潜在调控的mRNA取交集,以推测circ₇22调控的靶基因;（4）利用Cytoscape 3.7.0构建circ₇22-miRNA-mRNA调控网络;（5）用GO（Gene Ontology）和KEGG Pathway分析靶基因潜在的功能。结果:（1）下调circ₇22后有2037个基因存在差异表达,其中1422个基因表达下调,615个表达上调;（2）生物信息学预测circ₇22能与5个miRNA结合,分别是hsa-miR-324-5p、hsa-miR-326、hsa-miR-330-5p、hsa-miR-652、hsa-miR-661;利用这5个miRNA能预测出1541个潜在靶基因;（3）RNA-seq下调的基因与预测的潜在靶基因的交集有189个,GO分析显示这些基因主要与神经系统信号转导等功能有关;KEGG Pathway分析显示这些基因参与了信号转导、转录调控等相关信号通路。结论:circ₇22可能以ceRNA的作用机制影响多个基因的表达而在神经系统中发挥作用,对circ₇22在年龄相关性疾病的研究极具指导意义。