第一部分 蛛网膜下腔出血患者血浆中外泌体miRNA表达谱分析目的动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）属于临床急症的一种,具有非常高的病死率及病残率。准确鉴定SAH患者血液循环中的病理生理变化有助于改善SAH的诊疗水平。在本研究中,我们描绘了 SAH病人血浆中外泌体miRNA表达谱的差异并进行验证。方法1.二代测序（NGS）:选取来之SAH患者和健康对照者的3对血浆样本。使用试剂盒提取其中的外泌体。应用透射电镜了解外泌体的形态。利用免疫蛋白印迹检测了外泌体特征性蛋白CD63和Alix的表达。后将总外泌体中RNA建立小RNA库,应用Illumina Hiseq 2500进行测序,通过ACGT101-miR进行数据采集,统计学分析找出差异性表达的miRNAs。2.利用实时定量PCR（qRT-PCR）对测序结果进行验证:重新选取10对SAH患者和健康对照者血浆进行验证。通过试剂盒直接提取外泌体中RNA,反转录成cDNA,采用qRT-PCR对外泌体中miRNA进行定量检测,统计学分析SAH患者外周血中外泌体miRNA的表达情况。3.动物模型:向小鼠视交叉上池注血制作SAH小鼠模型,明确miRNA的遗传保守性,检测SAH模型中差异性miRNA的表达情况。结果1.透射电镜分析SAH患者血浆中外泌体粒径大约在30-100nm之间,特征性蛋白CD63和Alix表达阳性。2.二代测序依据人类基因组信息分别对这6个标本进行了九百万至一千五百万次读取。外泌体中含有＞50,000种不同的RNA序列。2139种已知miRNAs中有746中miRNAs被读取。按照矫正p值＜0.05,|log2（fold change）|＞1及表达水平不为低的标准,其中有六种miRNAs被认为表达有差异（hsa-miR-369-3p,hsa-miR-136b-3p,hsa-miR-410-3p,hsa-miR-195-5p,hsa-miR-486-3p,and hsa-miR-193b-3p）。3.通过qRT-PCR分析对测序结果进行验证,先用10例SAH患者血浆和10例正常对照组血浆进行检测分析,发现SAH血浆外泌体中hsa-miR-369-3p和hsa-miR-410-3p 低表达,而 hsa-miR-193b-3p 和 hsa-miR-486-3p 为高表达。4.通过SAH模型验证发现,在血浆外泌体中呈现出和患者血浆中相同的表达趋势,miR-369-3p 和 miR-410-3p 低表达,而 miR-193b-3p 和 miR-486-3p 为高表达;但在SAH模型脑组织中四种miRNA都为低表达。结论1.SAH患者血浆外泌体中miRNA与健康对照者血浆外泌体中miRNA存在差异。2.动物实验发现SAH患者与小鼠SAH模型血浆外泌体miRNAs具有一致性。3.差异性miRNA可能参与到SAH的病理生理过程,并且有可能作为治疗SAH的潜在靶点。第二部分 靶向蛛网膜下腔出血脑皮层的外泌体载药系统的建立目的血脑屏障（BBB）的存在使很多药物难以进入脑皮层,本研究中我们建立狂犬病病毒糖蛋白（RVG）修饰的外泌体用于靶向递送第一部分筛选的miRNA药物进入脑皮层。方法1.小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的提取和培养:选取6周龄成年雄性小鼠的长骨提取BMSCs,在培养皿中进行培养。2.RVG-Lamp2b过表达慢病毒载体构建:利用合成RVG-Lamp2b-mus基因序列片段,再将RVG-Lamp2b-mus基因序列加入购买的全基因质粒载体中,细菌培养后大量提取质粒进行测序,验证载体构建情况。用RVG-Lamp2b过表达质粒转染293T细胞,收获慢病毒,并用于后续靶点筛选实验。3.利用慢病毒感染BMSCs,随后提取转染了 RVG-Lamp2b过表达慢病毒的BMSCs的外泌体（Exosome,Exos）,利用western blot检测Lamp2b表达情况,确定RVG-Lamp2b融合蛋白是否成功表达在外泌体中。并通过透射电镜及蛋白印迹检测外泌体标记蛋白,证实外泌体提取是否成功。4.采用电穿孔技术将miR-193b-3p mimics转染到外泌体中,利用qRT-PCR检测外泌体中miR-193b-3p的量,明确电转成功与否。5.将FAM-miR-193b-3p,Exos/FAM-miR-193b-3p 和 RVG/Exos/FAM-miR-193b-3p分别注射到SAH模型的尾静脉中,脑组织进行切片,观察SAH模型中FAM荧光的情况。结果1.测序结果显示RVG-lamp2b过表达载体构建成功,并成功大量生产慢病毒载体。2.蛋白印迹显示与空白对照,阴性对照及阳性对照相比,转染了 RVG-Lamp2b过表达慢病毒的BMSCs产生的外泌体中Lamp2b的水平明显升高。3.透射电镜分析显示外泌体呈典型的双凹面形状;Western blot显示相对于BMSCs,外泌体特异性蛋白CD63及Alix表达更高,而GM-130不表达,表明外泌体提取成功。4.将miR-193b-3p mimics（实验组）和无序miRNA mimics（对照组）电转入RVG/Exos 中,qRT-PCR 检测 miR-193b-3p 的量,发现相对于对照组,miR-193b-3p的表达量在实验组中明显增加。5.RVG/Exos组小鼠颞叶底部FAM荧光明显多于Exos组,而FAM-miR-193b-3p组脑皮层中几乎没有FAM荧光。结论1.通过基因工程的方法可以使BMSCs产生特异性表达RVG-Lamp2b的外泌体。2.RVG修饰的外泌体可以穿透血脑屏障进入SAH脑皮层,实现靶向递送miRNA药物的目的。第三部分 靶向外泌体递送miR-193b-3p可通过减轻神经炎症来抑制小鼠SAH 后 EBI目的探讨RVG/Exos/miR-193b-3p在小鼠SAH后早期脑损伤中的作用及其机制研究。方法1.实验动物分组:靶点验证分为Sham组（假手术组）和SAH组,SAH组又分为12小时,24小时,48小时和72小时组;干预实验分为Sham组,SAH组,RVG/Exos组（未转染 mimics）,RVG/Exos/Scr 组（转染了无序 miRNA mimics）,和 RVG/Exos/miR组（转染了 miR-193b-3p mimics）五组。2.小鼠SAH模型及给药方式:采用视交叉上池注血法建立小鼠SAH模型,通过尾静脉注射方法进行给药。3.检测指标:qRT-PCR检测下游靶基因Hdac3、Hdac类基因、凋亡及炎症反应相关基因的表达情况;免疫印迹检测HDAC3及相关通路蛋白p65的表达情况;ELISA检测脑组织内炎症因子的变化;Garcia评分系统对小鼠进行神经功能评分;干湿实验评估脑水肿情况;Evan’s蓝染色评估血脑屏障（BBB）破坏情况;Fluoro-Jade C染色评估SAH小鼠神经变性情况。结果1.通过miRNA靶点预测下游靶基因为HDAC3,qRT-PCR检测发现Hdac3 mRNA在12-24小时达到高峰,HDAC3蛋白在24小时达到高峰,而其他Class IHDAC mRNA 24小时内增高未见具有统计学差异。2.通过RVG/Exos/miR-193b-3p的干预,显示其可以降低HDAC3的表达,但不影响HDAC3参与的Rela的基因表达,但影响p65的核内乙酰化水平。3.通过RVG/Exos/miR-193b-3p的干预,qRT-PCR检测凋亡相关基因Bcl-2及Caspase-3,提示miR-193b-3p可以改善SAH小鼠脑组织的凋亡情况;qRT-PCR和ELISA法检测提示miR-193b-3p处理后SAH后脑中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平显著降低。4.通过RVG/Exos/miR-193b-3p的干预,可以改善SAH模型小鼠的神经功能评分,降低脑水肿,维持BBB完整性及改善神经元变性。结论miR-193b-3p通过抑制HDAC3/NF-κB信号通路,减轻了 SAH后神经炎症,抑制了神经元凋亡,维持了 BBB完整性,降低了脑水肿,减少了神经元变性,改善了 SAH小鼠的预后。