背景肺癌是世界上最常见和最致命的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌(NSCLC)是最主要的组织病理学类型。研究发现,GATA2对RTK/RAS信号通路中KRAS或其他致癌基因突变的NSCLC细胞存活和生长至关重要;GATA2缺失降低了KRAS突变的NSCLC细胞生存能力,并显著抑制NSCLC发展。此外,GATA2还能通过调节蛋白酶体复合物、IL-1/NF-κB和Rho信号通路维持NSCLC细胞的存活。已知GATA2是GATA家族的一员,其作为转录因子能调控众多发育过程,并且GATA转录因子之间的相互作用在调控GATA家族基因的表达方面发挥重要作用。GATA2能与自身启动子区域结合并激活转录。然而,GATA1又与GATA2竞争性结合该启动子区域,通过破坏GATA2基因自身的转录来抑制GATA2的表达。因此,GATA1在GATA2的转录过程中发挥抑制作用。c-Myc在多种类型的癌细胞中都有组成性表达,它与启动子区域的E-boxes序列结合后,能激活众多参与细胞异常增殖的促癌基因转录,从而导致恶性肿瘤的形成。c-Myc基因的上调在胃癌、宫颈癌、结肠癌和NSCLC等恶性肿瘤中均有被发现。因此,c-Myc被认为是治疗癌症的一个潜在目标。近年人们发现长非编码RNA(lncRNA)在NSCLC等多种肿瘤的发生机制中发挥着重要的调控作用。lncRNA可以靶向转录激活因子或抑制因子调控下游基因的表达。目前研究报道了一种lncRNA的作用模式,即基因附近转录出来的lncRNA能通过招募转录因子或染色质修饰因子调控邻近基因的表达。例如,CCND1基因附近转录的lncRNA CCND1,它能结合TLS蛋白并使其转变为活性构象,从而结合到CCND1启动子上的CBP/p300复合物,最终抑制CCND1基因的转录。目的探讨lncRNA GATA2-AS1调控NSCLC生长及其受到c-Myc靶向调节的具体分子机制,为开拓NSCLC新的治疗靶点提供实验依据。材料与方法1.细胞培养和转染:在添加10%胎牛血清、1mM丙酮酸钠和100 mg/ml链霉素的DMEM培养基中培养A549细胞(KRAS突变)和HEK293T细胞。2.RNA干扰:HEK293T细胞转染对照组或实验组siRNA后,在Opti-MEM培养基培养12小时后换用10%胎牛血清的DMEM培养基,继续培养48小时。收集细胞,采用免疫印迹法和荧光定量PCR方法对敲除效率进行评估。3.实时荧光定量PCR(qRT-PCR):用Trizol提取总RNA,然后逆转录成cDNA;采用SYBR和ROX对照染料进行实时荧光定量PCR分析。4.免疫印迹(WB):收集细胞,加入缓冲液后95℃煮蛋白10~15分钟,然后将蛋白按照大小分离。5.染色质免疫共沉淀(ChIP):室温下将A549细胞用1%甲醛交联10分钟,甘氨酸终止反应。处理后的细胞用裂解缓冲液重悬。用GFP抗体或对照IgG偶联的蛋白与细胞裂解液孵育。洗脱后的产物经PCR扩增。6.RNA免疫共沉淀(RIP):1~3×10~7个细胞用低渗缓冲液裂解和离心。细胞裂解液经蛋白A/G beads预处理后,在4℃条件下与偶联相应抗体的A/G beads孵育。经多次洗涤后,用洗脱缓冲液洗脱beads上结合的免疫复合物,然后用蛋白酶K分离提取出蛋白结合的RNA。纯化的RNA可用于RT-PCR分析。7.克隆形成实验:将转染了对照组、GATA2或GATA2-AS1 siRNA的A549细胞于6孔板中进行传代。一周后,用预冷的10%甲醇固定细胞5分钟,室温下用结晶紫染色30分钟。经过多次冲洗,拍照。8.细胞周期实验:收集细胞后洗涤,在4℃条件下用70%乙醇固定过夜;然后离心5分钟,PBS洗涤2次,室温下加入PBS孵育30分钟;最后用流式细胞仪检测细胞周期的分布。结果1.GATA2-AS1抑制NSCLC细胞的增殖lncRNA GATA2-AS1是位于人类基因组第3号染色体GATA2基因反义链上的非编码性抑癌基因。首先在A549细胞中通过siRNA敲低GATA2-AS1,发现GATA2转录的mRNA水平上调;在GATA2-AS1缺失的细胞中,GATA2蛋白水平也升高。然后通过对蛋白酶体复合物、IL-1/NF-κB和Rho信号这三种途径中GATA2靶基因表达情况进行检测,发现在GATA2-AS1敲低细胞中均表现出较高的表达水平。随后在A549细胞中利用siRNA敲低GATA2-AS1,发现一旦缺少GATA2-AS1就会加快A549细胞的增殖,而同时敲低GATA2-AS1和GATA2,GATA2-AS1就无法加快细胞的增殖。以上表明GATA2-AS1通过抑制GATA2的表达从而阻止NSCLC细胞的生长。2.GATA2-AS1结合GATA1通过在A549细胞中进行核质分离实验分析GATA2-AS1的亚细胞定位,发现它主要位于细胞核。随后进行RIP证明异位表达的GATA1能够与GATA2-AS1相互结合;反之内源性GATA2-AS1能够与GATA1共沉淀,说明GATA2-AS1与GATA1蛋白在细胞核内存在相互作用。然后采用两阶段RIP分析GATA家族共调节因子FOG1是否包含在GATA2-AS1和GATA1复合物中。第一阶段使用Flag抗体去沉淀Flag-GATA1,它可以捕获高水平的FOG1和GATA2-AS1;第二阶段使用FOG1抗体去沉淀FOG1,发现能够共沉淀Flag-GATA1和GATA2-AS1。结果表明,GATA1、FOG1和GATA2-AS1在GATA2启动子处形成一个三聚体,然后调控GATA2转录。3.GATA2-AS1增强GATA1的抑制功能进一步利用GATA1抗体进行ChIP实验,检测到在GATA2启动子上游约2.8kb处有一段GATA结合序列,该序列与GATA1的结合率会随着GATA2-AS1的减少而降低。这表明GATA2-AS1增加了GATA1与GATA2启动子的结合,从而增强GATA1对GATA2表达的抑制作用。随后在过表达GATA2-AS1的同时敲低GATA1,发现GATA2-AS1对GATA2表达的抑制作用可以通过GATA1沉默得到恢复,进一步证实GATA2-AS1通过GATA1调控GATA2。4.GATA2-AS1通过GATA2抑制NSCLC细胞的增殖首先检测到GATA2-AS1敲低的A549细胞中GATA2靶基因的表达上调,而在敲低GATA2-AS1时再去敲低GATA2,发现对GATA2靶基因的作用消失,表明GATA2介导了GATA2-AS1对NSCLC细胞生长的影响。然后通过克隆形成实验证明,A549细胞沉默GATA2-AS1的表型可以被GATA2 siRNA所恢复,通过细胞周期分析证实了GATA2敲低和GATA2-AS1及GATA2双敲低细胞之间的关系,说明GATA2-AS1通过GATA2调控NSCLC细胞生长的机制。5.c-Myc转录调控GATA2-AS1通过生物信息学分析,在GATA2-AS1启动子上游1964bp位点找到了c-Myc潜在的结合序列(CACGTG)。沉默c-Myc能诱导NSCLC细胞中GATA2-AS1表达上调,而在A549细胞中转染外源性c-Myc使其增加时,GATA2-AS1表达水平逐渐降低。随后使用c-Myc抗体进行ChIP实验,证实c-Myc与GATA2-AS1启动子上游1964bp位点结合。此外,通过siRNA沉默敲除MIZ-1的表达,发现缺失的MIZ-1能够恢复c-Myc过表达引起的GATA2-AS1下调,说明c-Myc通过与MIZ-1相互作用调控了对GATA2-AS1的转录抑制。6.GATA2-AS1在癌组织中表达较低对NSCLC标本中GATA2-AS1的表达情况进行检测发现,大多数癌组织表达的GATA2-AS1水平低于癌旁组织;同时这些癌组织也显示出相对较高的c-Myc和GATA2表达水平;但癌组织与癌旁组织组织的GATA1水平无明显变化。结果表明,GATA2-AS1通过抑制NSCLC细胞的增殖而发挥抑癌作用。结论1.lncRNA GATA2-AS1是一个非编码性抑癌基因,位于人类基因组第3号染色体GATA2基因的反义链上;其转录方向与GATA2相反,对NSCLC细胞的发生和发展具有抑制作用。2.lncRNA GATA2-AS1通过在GATA2启动子区域与GATA1蛋白相互结合,从而抑制GATA2基因的转录,阻止NSCLC细胞的增殖;此外,证实GATA2-AS1能通过调控蛋白酶体复合物、IL-1/NF-κB和Rho信号通路抑制NSCLC细胞的生长。3.lncRNA GATA2-AS1在NSCLC细胞中能被c-Myc转录抑制调控。4.本研究证明了c-Myc→GATA2-AS1→GATA1→GATA2信号通路在NSCLC发展中的作用,为NSCLC的治疗提供了潜在靶点。