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[目的]构建重组梅毒螺旋体(Tp)黏附素Tp0751的大肠埃希菌菌影(EBG)(r Tp0751-EBG),检测其免疫活性,为深入探讨其在抗Tp感染中的潜在免疫保护作用奠定基础。[方法](1)EBG的制备与鉴定:将含有噬菌体PHi X174裂解基因E的质粒p HH43转化入E.coli DH5α,温控诱导使其形成BG并计算裂解效率,琼脂糖DNA电泳和透射电镜(TEM)鉴定。(2)膜锚定载体的构建与表达:PCR扩增膜锚定基因E’(含linker),与p ET28a-Tp0751构建膜锚定载体p ET28a-E’-Tp0751,转化E.coli BL21诱导表达,WB鉴定E’-Tp0751的表达。(3)r Tp0751-EBG表达质粒的构建:将含裂解基因盒E-box的p HH43与p ET-32a质粒酶切、连接,构建重组质粒p ET32a-E-box,再将其p ET28a-E’-Tp0751构建重组表达质粒p ET-28a-E’-Tp0751-E-box。(4)r Tp0751-EBG表达与鉴定:将p ET28a-E’-Tp0751-E-box转化E.coli BL21,28℃诱导表达Tp0751,升温至42℃热诱导裂解,计算裂解率。WB鉴定Tp0751的表达;TEM鉴定BG。(5)动物免疫:分别用r Tp0751-EBG肌注、r Tp0751-EBG鼻滴、r Tp0751肌注(加弗氏佐剂)、EBG肌注及PBS肌注途径免疫C57BL/6小鼠3次。每次免疫前及末次免疫后第10d收集血清和生殖道灌洗液,末次免疫后第10d制备小鼠脾细胞。(6)r Tp0751-EBG免疫活性测定:用间接ELISA法检测血清特异性抗体Ig G抗体及生殖道灌洗液中s Ig A抗体水平,CCK-8法检测r Tp0751刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,间接ELISA检测IFN-γ表达水平。[结果](1)EBG制备与鉴定:42℃下p HH43上E基因被激活导致E.coli裂解形成BG,裂解率可达98.13%;琼脂糖凝胶电泳未观察到DNA条带,TEM显示绝大部分细菌都裂解成空泡状并保持细菌基本形态。(2)膜锚定载体的构建与表达:PCR扩增出大小约为180 bp左右的片段,与膜锚定基因E’一致;SDS-PAGE显示一分子量约28KDa的可溶性蛋白,WB显示该蛋白仅与Tp感染兔血清反应。(3)r Tp0751-EBG表达质粒的构建、表达与鉴定:酶切及测序结果表明含有目的基因Tp0751和裂解基因盒E-box的重组质粒构建成功。经28℃诱导表达一分子量约28 KDa大小的明显条带,WB显示其仅与Tp感染兔血清反应。在42℃诱导重组BG的OD600值开始下降,裂解率为96.37%。TEM鉴定结果与EBG结果类似。(4)r Tp0751-EBG诱导系统和黏膜体液免疫应答水平:r Tp0751-EBG肌注组、r Tp0751-EBG鼻滴组和r Tp0751肌注组小鼠血清特异性Ig G水平随免疫次数增加而增加,第4周达到最大值,抗体效价均高于1︰25 600,明显高于PBS和EBG肌注对照组(P<0.01),但前三组间无明显差异。r Tp0751-EBG肌注和鼻滴组的小鼠生殖道黏膜分泌液中s Ig A水平随免疫次数增加而增加,于免疫后第四周达到最高,抗体效价均为1︰6400,高于r Tp0751肌注组、PBS和EBG肌注组(P<0.05),但前两组间差异无显著性。(5)r Tp0751-EBG诱导系统细胞免疫应答水平:r Tp0751-EBG肌注组、r Tp0751-EBG鼻滴组、r Tp0751肌注组的刺激指数(SI)均显著高于EBG和PBS肌注组(P<0.01),但前三组间无明显差异。r Tp0751-EBG肌注组、r Tp0751-EBG鼻滴组的IFN-γ均高于Tp0751肌注组(P<0.05)、BG肌注组和PBS组(P<0.01),Tp0751肌注组高于BG肌注组和PBS组(P<0.05),但r Tp0751-EBG肌注与鼻滴组间无明显差异。[结论](1)成功构建梅毒螺旋体黏附素Tp0751的重组蛋白菌影r Tp0751-EBG;(2)r Tp0751-EBG可诱导小鼠产生较强的黏膜和系统的特异性体液应答和系统细胞免疫应答。