目的:在世界范围内肺癌已经成为常见的恶性肿瘤之一,死亡率和发病率均高于其他种类的恶性肿瘤,且呈现出逐年增高的趋势,是危害人类健康和生命的主要疾病之一。为了更好地寻找肺癌的有效疗法,肺癌发病机制的研究成了肺癌治疗研究中的重中之重。大量研究表明,肺癌的发生发展不仅是多因素综合过程,而且是一个多步骤的渐发过程,主要与肺组织的衰老、基因易感性、端粒缩短、慢性炎症反应以及表观遗传学改变有关。近年来RNA的表观遗传修饰备受科研工作者的青睐,随着人们对RNA甲基化修饰的不断了解和探索,发现机体内RNA m6A平衡打破以后,可引起多种疾病,例如阿尔兹海默症、肥胖、HIV感染、肿瘤等。目前研究结果显示,m6A主要与神经胶质瘤、急性髓细胞白血病、肝癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤发生发展密切相关。自1983年从大肠杆菌变异株中发现Alk B基因以来,人们在人类基因组中相继发现了9种Alk B同家族蛋白ALKBH1-8和FTO。此家族蛋白主要负责DNA和RNA的甲基化修饰。有研究发现,FTO和ALKBH5主要催化DNA 6m A的去甲基化作用,进而影响下游基因的转录和翻译。作为Alk B家族的一员,目前已有研究发现,ALKBH1也具有核酸的去甲基化功能,主要催化的是ss DNA和RNA的3-mec去甲基化。随着研究的不断深入,有文献报道ALKBH1可调控t RNA 1m A去甲基化而影响蛋白的翻译过程;ALKBH1通过调控DNA的6m A去甲基化,进而影响星形胶质瘤的发展;沉默ALKBH1基因可引起DNA和RNA m6A修饰,进而影响肝癌和胃癌的发生发展。但是,目前为止ALKBH1在RNA m6A去甲基化作用中的贡献比、具体的催化机制和这种催化对于肺癌的影响并不是十分明了。综合上述研究现状,本课题采用肺癌细胞和肺正常细胞以及乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型,通过添加ALKBH1蛋白“底物类似物”NOG、沉默和过表达ALKBH1基因,从体内和体外共同探索了ALKBH1以及m6A在肺癌中的作用;利用蛋白表达、纯化、结晶、结构解析、SPR实验、EMSA实验、蛋白热转移实验、LC-MS/MS等技术,以ALKBH1蛋白结构为基础,探索了ALKBH1促肺癌的分子机制。方法:1.ALKBH1在肺癌中的作用研究正常培养肺上皮细胞BEAS-2B和肺癌细胞A549、H1299、H1650;采用RT-PCR技术检测不同细胞系中ALKBH1基因表达水平;Western blot技术检测不同细胞系中ALKBH1蛋白表达水平。2.ALKBH1底物类似物NOG对肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭的影响MTT实验确定NOG给药浓度;根据MTT实验结果,用不同浓度NOG处理A549细胞2天,采用RT-PCR和Western blot技术检测NOG对A549细胞ALKBH1基因和蛋白表达水平;RNA dot blot实验检测m6A水平变化;EdU实验和平板克隆实验检测NOG对细胞增殖能力的影响;Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验检测NOG对细胞迁移和侵袭能力的影响。3.沉默ALKBH1基因对肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭的影响采用siRNA干扰技术对A549细胞进行ALKBH1基因沉默;采用RT-PCR和Western blot技术检测ALKBH1沉默效果;RNA dot blot实验检测m6A水平变化;MTT实验检测沉默ALKBH1后细胞活力变化;EdU实验检测沉默ALKBH1对细胞增殖能力的影响;细胞划痕实验检测沉默ALKBH1对细胞迁移能力的影响;Transwell侵袭实验检测沉默ALKBH1对细胞侵袭能力的影响。4.过表达ALKBH1基因对肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭的影响利用分子克隆技术,构建hALKBH1-pcDNA3.1-EGFP重组质粒;采用质粒转染技术对A549细胞进行ALKBH1基因过表达;采用RT-PCR和Western blot技术检测ALKBH1过表达效果;RNA dot blot实验检测m6A水平变化;MTT实验检测过表达ALKBH1后细胞活力变化;细胞划痕实验检测过表达ALKBH1对细胞迁移能力的影响;Transwell侵袭实验检测过表达ALKBH1对细胞侵袭能力的影响;极限稀释法检测过表达ALKBH1对细胞自我更新能力的影响。5.体内验证ALKBH1基因对肺癌发生发展的作用采用乌拉坦试剂诱导小鼠自发肺癌;HE染色检测小鼠肺组织病理特征;免疫组化实验和Western blot实验检测小鼠肺组织中肺腺癌标志物PCNA、CK7和ALKBH1的蛋白表达;RT-PCR实验检测小鼠肺组织中ALKBH1基因水平变化;RNA dot blot实验检测小鼠肺组织中m6A水平变化。6.mALKBH1及其突变体的蛋白表达和纯化在NCBI数据库中检索得到编码mALKBH1的基因序列（Gene ID:211064）,通过Snap Gene软件确认Nde I和Xho I限制性酶切位点的选择。设计特异性引物,在特异性引物两端分别添加保护碱基和Nde I、Xho IA限制性酶切位点。普通PCR扩增目的基因片段,将mALKBH1基因片段与p ET-28a（+）载体分别进行Nde I和Xho I限制性双酶切反应后,用T4连接酶进行连接反应,得到mALKBH1-p ET-28a（+）重组质粒。采用Quick Change定点突变技术,构建mALKBH1突变体的表达载体。mALKBH1及其突变体均在E.coli BL 21-Codon Plus（DE3）菌株中表达;蛋白均需要经过2步纯化:Ni-NTA亲和纯化→Hi Trap Q HP（1m L）阴离子交换柱纯化。7.mALKBH1蛋白结构解析得到较纯的mALKBH1蛋白以后,首先进行了晶体的初筛和优化;接着用银染实验分析了晶体的特性;最后晶体经过中山大学药学院室内X射线单晶衍射仪筛选后,在SSFR进行数据收集,使用HKL2000软件进行数据指标化、归一化和积分。最终我们获得了分辨率为约3?的衍射数据;由于未找到同源性较高的蛋白进行分子置换,为了解决相位问题,经过多种方式的尝试,最终我们进行了硒代蛋白的表达、纯化、结晶和衍射,获得了分辨率约2.8?的数据;结构解析和精修是通过软件CCP4和Phenix完成的。8.mALKBH1蛋白体外催化活性研究首先采用SPR技术验证mALKBH1蛋白与2OG的结合;接着采用蛋白热转移实验检测了mALKBH1及其突变体蛋白的热稳定性以及与2OG的结合能力差异;另外采用EMSA实验探索了mALKBH1及其突变体蛋白与m6A的结合差异;最后利用RNA dot blot实验和LC-MS/MS实验检测了mALKBH1及其突变体体外催化RNA m6A的活性差异。9.统计学分析数据分析处理采用SPSS20.0软件,以Mean±SD表示,采用One way ANOVA进行统计,若方差齐则采用LSD统计方法,若方差不齐则采用Dunnett’s T3统计方法,P<0.05时定义为具有统计学显著性差异,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。结果:1.ALKBH1和m6A在肺癌细胞细中高表达本实验采用正常肺上皮细胞BEAS-2B作为对照,检测肺癌细胞A549、H1299和H1650中ALKBH1蛋白表达水平。培养后选择4株细胞代数相同,状态良好时收样。采用RT-PCR技术检测不同细胞系中ALKBH1基因表达水平;Western blot技术检测ALKBH1蛋白表达水平。Western blot结果显示:相较于正常肺上皮细胞BEAS-2B,肺癌细胞A549、H1299和H1650中ALKBH1蛋白表达水平均呈现升高趋势。蛋白表达分别升高为576.72%±85.13%（P<0.001）,762.46%±84.01%（P<0.001）,621.58%±75.44%（P<0.001）。RT-PCR结果显示:相较于正常肺上皮细胞BEAS-2B,肺癌细胞A549、H1299和H1650中ALKBH1基因表达水平均呈现升高趋势。基因表达的升高倍数分别为10.9±1.1（P<0.001）,4.01±0.17（P<0.001）,20.80±0.57（P<0.001）。2.NOG显著抑制肺癌细胞A549的增殖、迁移、侵袭能力采用0.1%DMSO处理细胞组作为对照,选对数生长期且状态良好的A549细胞,种板,NOG处理2天,收样。采用RT-PCR和Western blot技术检测NOG对A549细胞ALKBH1基因和蛋白表达水平的影响;RNA dot blot实验检测m6A水平变化;EdU实验和平板克隆实验检测NOG对细胞增殖能力的影响;Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验检测NOG对细胞迁移和侵袭能力的影响。Western blot实验结果显示:NOG处理的A549细胞中ALKBH1蛋白表达水平无显著性变化。各组ALKBH1蛋白表达水平（%）为:100.00%±14.00%,98.29%±14.64%（P>0.05）,99.56%±13.09%（P>0.05）。RT-PCR实验结果显示:NOG处理的A549细胞中ALKBH1基因表达水平无显著性变化。各组ALKBH1基因表达水平（倍数）为:1.00±0.04,1.20±0.04（P>0.05）,0.95±0.11（P>0.05）。RNA dot blot实验结果显示:NOG处理的A549细胞中m6A水平显著升高。各组m6A水平（%）为:100.00%±31.38%,181.26%±9.78%（P<0.001）,168.08%±37.69%（P<0.001）。EdU实验结果显示:NOG可以显著抑制A549细胞的增殖能力,且抑制作用呈现浓度依赖性。不同浓度NOG对A549细胞增殖能力的抑制百分比分别为:81.64%±8.99%（P>0.05）,36.19%±1.67%（P<0.001）,28.79%±1.95%（P<0.001）。平板克隆实验结果显示,NOG可以显著抑制A549细胞的克隆形成能力。不同浓度NOG对A549细胞克隆形成能力的抑制百分比分别为:27.33%±6.51%（P<0.001）,45.67%±4.04%（P<0.001）。Transwell迁移实验结果显示,NOG抑制A549细胞的迁移能力。不同浓度NOG下对应结晶紫的吸光度分别为:0.413±0.013,0.405±0.022（P>0.05）,0.390±0.005（P>0.05）,0.385±0.018（P<0.05）。同时Transwell侵袭实验结果显示,NOG抑制A549细胞的侵袭能力。不同浓度NOG下对应结晶紫的吸光度分别为:0.823±0.038,0.753±0.040（P>0.05）,0.720±0.017（P<0.05）,0.640±0.052（P<0.01）。3.沉默ALKBH1基因抑制肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭选对数生长期且状态良好的A549细胞,种6孔板,siRNA转染干扰12小时,正常培养48小时,收样。采用RT-PCR和Western blot技术检测ALKBH1沉默效果;RNA dot blot实验检测m6A水平变化;MTT实验检测沉默ALKBH1后细胞活力变化;EdU实验检测沉默ALKBH1对细胞增殖能力的影响;细胞划痕实验检测沉默ALKBH1对细胞迁移能力的影响;Transwell侵袭实验检测沉默ALKBH1对细胞侵袭能力的影响。Western blot结果:不同位点siRNA干扰蛋白水平效果（%）分别为:41.14%±3.32%（P<0.001）,32.01%±3.49%（P<0.001）,41.11%±4.01%（P<0.001）。RT-PCR实验所示:不同位点siRNA干扰基因水平效果（倍数）分别为:0.026±0.003（P<0.001）,0.264±0.004（P<0.005）,0.249±0.020（P<0.005）。RNA dot blot实验所示:siRNA干扰ALKBH1后,可以显著升高A549细胞中m6A水平,对实验结果进行半定量,m6A水平（%）分别为:275.52%±0.05%（P<0.001）,125.16%±0.25%（P<0.01）,384.63%±0.05%（P<0.001）。MTT实验检测A549细胞活力,结果所示,siRNA干扰ALKBH1后,A549细胞活力受到显著抑制。EdU实验前,采集明场下A549细胞照片,观察转染后细胞密度变化。结果所示:siRNA干扰ALKBH1表达后,A549细增殖能力受到显著抑制。划痕实验检测A549细胞迁移能力,结果所示:siRNA干扰ALKBH1表达后,A549细迁移能力受到显著抑制。Transwell侵袭实验检测A549细胞侵袭能力,结果所示:siRNA干扰ALKBH1表达后,A549细侵袭能力受到显著抑制。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。4.过表达ALKBH1基因促进肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭利用分子克隆技术,构建hALKBH1-pcDNA3.1-EGFP重组质粒;采用质粒转染技术对A549细胞进行ALKBH1基因过表达;采用RT-PCR和Western blot技术检测ALKBH1过表达效果;RNA dot blot实验检测m6A水平变化;MTT实验检测过表达ALKBH1后细胞活力变化;细胞划痕实验检测过表达ALKBH1对细胞迁移能力的影响;Transwell侵袭实验检测过表达ALKBH1对细胞侵袭能力的影响;极限稀释法检测过表达ALKBH1对细胞增殖能力的影响。RT-PCR结果所示:以对照组ALKBH1 mRNA水平为基准,计算过表达组ALKBH1 mRNA水平（倍数）,两组结果分别为:1±0.06,2.02±0.24（P<0.01）。Western blot结果所示:以对照组ALKBH1蛋白水平为基准,计算过表达组ALKBH1蛋白水平（%）,两组结果分别为:100%±6.24%,146.5%±8.77%（P<0.01）。RNA dot blot结果所示:过表达ALKBH1基因后,可以显著降低A549细胞中m6A水平,对实验结果进行半定量,m6A水平（%）分别为:100%±4.81%,33.73%±5.43%（P<0.001）。5.本实验采用划痕法检测过表达ALKBH1基因对A549细胞迁移能力的影响,结所示:过表达ALKBH1基因可使A549细迁移能力提高306.7%±67.23%（P<0.01）。Transwell侵袭结果所示:过表达ALKBH1基因使A549细侵袭能力增加,侵袭率升高到246.7%±32.83%（P<0.01）。极限稀释法实验结果所示:过表达ALKBH1基因使A549细胞增殖能力提高,自我更新率由对照组的1/3.56升高到1/2.29。6.体内验证ALKBH1基因对肺癌发生发展的作用采用乌拉坦试剂诱导小鼠肺癌模型;HE染色检测小鼠肺组织病理特征;免疫组化实验检测小鼠肺组织中PCNA、CK7和ALKBH1蛋白表达水平;Western blot实验检测小鼠肺组织中ALKBH1蛋白表达水平;RT-PCR实验检测小鼠肺组织中ALKBH1基因水平变化;RNA dot blot实验检测小鼠肺组织中m6A水平变化。乌拉坦诱导小鼠肺癌模型实验结束后,剖离小鼠肺组织,拍照观察小鼠肺部肿瘤结节数;干湿重法检测小鼠肺组织含水量变化。实验结果可知,与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠的肺组织均出现肉眼可见的肺结节,且荷瘤率达到100%。组织含水量检测结果显示,与正常组小鼠肺组织相比,模型组小鼠肺组织质量和含水量均显著升高。实验过程中各组小鼠生长正常,随着实验进程的推进,正常对照组小鼠活动状态良好、进水进食正常、毛发洁白柔顺有光泽,体重均逐渐增加。肺癌模型组小鼠,活动和进水进食情况均有所下降,表现出精神萎靡倦怠、毛发枯燥无泽,体重则呈现出降低趋势。同时随着实验周期的延长,模型组小鼠死亡发生率逐渐增高。小鼠肺组织HE染色实验结果显示:与正常组小鼠肺组织相比,模型组小鼠肺组织的细胞排列紊乱、细胞核变大且染色加深、出现炎症细胞浸润,同时可以看到细胞大量增殖的癌巢部位。免疫组化实验结果所示,相较于正常肺组织,模型组小鼠肺组织中PCNA、CK7、ALKBH1表达均升高。Western blot实验结果所示,模型组小鼠肺组织中ALKBH1蛋白水平显著升高,升高水平（%）为133.4%±6.59%（P<0.01）。RT-PCR实验结果所示,模型组小鼠肺组织中ALKBH1基因水平显著升高,升高水平（倍数）为2.17±0.15（P<0.01）。RNA dot blot实验结果所示,模型组小鼠肺组织中m6A水平显著升高,升高水平（%）为213.4%±40.99%（P<0.001）。7.mALKBH1及其突变体蛋白表达和纯化SDS-PAGE电泳结果显示,在45.4kDa分子量处,可见明显目的蛋白表达条带,此条带分子量大小与mALKBH1蛋白预测分子量大小一致,结果说明mALKBH1蛋白能进行可溶表达。另外经过Ni–NTA结合,Ni–NTA buffer A洗涤除去非特异结合蛋白,Ni–NTA buffer B洗脱目标蛋白,得相对纯的蛋白,纯度可达85%以上。经过Hi Trap Q HP（1m L）阴离子交换柱对目标蛋白进行纯化。SDS-PAGE电泳所示,经过Hi Trap Q HP纯化后,蛋白纯度可达95%以上,且蛋白较纯的部分主要存在于“UB”和“peak 1”部分。8.mALKBH1蛋白结构解析初步得到mALKBH1晶体:蛋白主要有4聚体和8聚体2种存在形式,由2个α螺旋和10个β片折叠形成。银染实验结果显示mALKBH1蛋白晶体存在降解条带。根据mALKBH1蛋白结构以及关键氨基酸的比对结果显示,mALKBH1蛋白氨基酸Y184、H231、D233、H287、R338以及R344在Alk B家族中保守性较强,且是结合2OG和Fe（II）的关键氨基酸。9.mALKBH1蛋白体外催化活性研究SPR实验结果显示,2OG与mALKBH1蛋白结合的KD值为9.16e-5,说明蛋白mALKBH1与2OG结合较好;蛋白热转移试验结果显示,mALKBH1与其辅因子2OG和Fe（II）结结合后Tm值均变大,说明与辅因子结合后mALKBH1稳定性均增加;采用蛋白热转移试验对mALKBH1蛋白的Y184A、H231A、D233A、H287A、R338A以及R344A突变体热稳定性进行探索,结果发现突变体Y184A、H231A、D233A、H287A、R338A的Tm值相较于野生型（WT）均显著减小,说明这些突变体的热稳定性相较于WT较差;突变体R344A Tm值变大,说明R344氨基酸突变以后蛋白稳定性有所增加。EMSA实验结果显示,与WT相比突变体蛋白与m6A的结合减少。体外酶活实验和LC-MS/MS实验结果显示,mALKBH1蛋白可以催化RNA的m6A去甲基化,同时突变掉上述mALKBH1蛋白中关键氨基酸后,蛋白的催化活性显著降低。结论:本课题研究了ALKBH1对肺癌发生发展的作用,从体内外证明了ALKBH1通过调控RNA m6A甲基化修饰调控肺癌的发生发展。体外沉默ALKBH1基因可以抑制肺癌细胞A549的增殖、迁移、侵袭能力;体外过表达ALKBH1基因后肺癌细胞A549的增殖、迁移、侵袭能力受到显著增强。乌拉坦诱导小鼠肺癌模型的实验结果证明,小鼠肺癌组织中ALKBH1蛋白水平和基因水平均升高,表明ALKBH1在肺癌的发生发展中发挥着重要作用。同时,解析了mALKBH1蛋白的结构;体外证明了mALKBH1对RNA m6A表现出良好的去甲基化催化活性;证明了Y184、H231、D233、H287、R338以及R344在mALKBH1蛋白热稳定性维持、结合辅因子和催化底物、催化活性维持等方面发挥着关键性作用。因此,本研究为阐明ALKBH1催化RNA去甲基化原理提供了基础,同时为寻找ALKBH1抑制剂奠定了结构基础,也为以ALKBH1为靶点治疗肺癌提供了新的思路。