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山羊支原体山羊肺炎亚种自1976年首次从肯尼亚病山羊体内分离到以来,已被证明是山羊传染性胸膜肺炎的病原。山羊传染性胸膜肺炎对非洲和亚洲山羊养殖业的危害较为严重,是世界动物卫生组织所列法定报告传染病之一。目前,病原分离鉴定是确诊该病的首要证据,但其病原营养要求苛刻,分离培养困难。该病在非洲、亚洲等数十个国家和地区都有流行,但只有14个国家分离到该病原。我国山羊传染性胸膜肺炎的报道始于上世纪20年代,但迄今仅辛九庆等于2007年从山东分离到一株山羊支原体山羊肺炎亚种。本研究将采自甘肃某羊场疑似患有山羊传染性胸膜肺炎的山羊肺脏病料无菌接种到KM2液体培养基中,37℃培养4~7d后,将液体培养物均匀涂布于KM2固体培养基上培养。挑取具有典型“煎蛋样”单个菌落,再接种KM2液体培养基。如此经过三次克隆纯化后,得到一株纯培养物,命名为M1601。对M1601进行形态学观察、生化试验鉴定、PCR及PCR酶切鉴定,结果均符合山羊支原体山羊肺炎亚种特征。将M1601接种健康山羊,可致类似山羊传染性胸膜肺炎症状。提取M1601基因组,经扩增、克隆和测序得到16s rRNA基因2个操纵子(rrnB和rrnA)以及5个看家基因(fusA、glpQ、gyrB、lepA和rpoB)序列,GenBank登录号分别为:HM155915、GU736670、GU736671、GU736672、GU736673、GU736674和GU736675。将M1601 16s rRNA基因rrnB序列和GenBank数据库中公布的丝状支原体簇7个成员的rrnB序列和腐败支原体的16s rRNA基因进行同源性分析并建立系统发生树,序列分析结果显示M1601与山羊支原体山羊肺炎亚种模式株F38以及分离株4/2LC的同源性高达99.8%,与丝状支原体簇其他成员山羊支原体山羊亚种模式株California kid、牛群7型模式株PG50、丝状支原体丝状亚种小菌落型模式株PGI、丝状支原体丝状亚种大菌落型模式株Y-Goat、丝状支原体山羊亚种模式株PG3的同源性分别为99.1%、99.0%、98.8%、98.9%和99.0%,与腐败支原体模式株ks-I的同源性仅为97.1%;进化树显示M1601与F38、4/2LC在同一个分枝上,其置信概率为100%。进一步使用Bioedit软件将山羊支原体山羊肺炎亚种M1601、95043、9231Abosma株和丝状支原体簇其他5个成员模式株的5个看家基因进行了首尾相连的组装,使用组装后获得的序列构建分子进化树,结果显示M1601和95043、9231Abosma分离株在同一个分枝上,其置信概率为93%。16s rRNA基因序列同源性比较、系统树分析以及5个看家基因的系统发生树分析结果进一步证明, M1601为山羊支原体山羊肺炎亚种。采用醇酚法从M1601培养物上清中提取多糖,定量后作为抗原,致敏醛化鞣酸化的绵羊红细胞,建立了检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的间接血凝试验方法。该方法特异性强、敏感性高、重复性好,检测丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、溶血性曼氏杆菌、猪肺炎支原体的阳性血清均为阴性;M1601人工感染山羊14d后可以检测出阳性抗体,对田间采集的817份山羊血清进行检测,阳性率为14.1%。结果表明该方法可用于山羊支原体山羊肺炎亚种的血清学诊断及流行病学调查。