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背景与目的骨髓造血微环境的异常是白血病形成和发展过程中的重要环节之一,在白血病骨髓造血微环境的形成过程中,既包含有骨髓异常缺氧微环境和骨髓血管新生的形成过程,也有骨髓微环境内各种粘附和趋化因子(包括VEGF、SDF-1等)的分泌异常。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)作为一种重要的转录因子,其在肿瘤及肿瘤基质的形成过程中发挥着重要的转录调控作用,已有研究表明HIF-1α参与了血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)、基质衍生因子-1 (Stromal derived factor-1,SDF-1)的表达调控,同时,它还直接或者间接地参与了血管新生、基质缺氧微环境的发生以及细胞增殖与凋亡的调节过程。HIF-1α可能是白血病骨髓造血微环境形成过程中的重要调控因子。本研究拟构建针对HIF-1α的miRNA干扰质粒载体,以研究沉默白血病骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)HIF-1α表达后,对BMSCs以及与之共培养的白血病细胞功能的影响,探讨HIF-1α在白血病骨髓造血微环境形成过程中的调控机制,为探索从新的角度治疗白血病提供理论依据。研究方法1、分离培养急性白血病和正常对照骨髓基质细胞,RT-PCR法检测骨髓基质细胞HIF-1αmRNA的表达,免疫组织化学法检测骨髓基质细胞P53、PTEN、HIF-1α表达和分布,ELISA法检测骨髓基质细胞培养上清SDF-1、VEGF的表达;2、设计合成针对HIF-1α的3组pre-miR RNA干扰序列,构建带有报告基因EmGFP的pcDNA?6.2-GW/EmGFP-HIF-1αmiR干扰质粒,测序鉴定构建成功后,应用脂质体Lipofectamine 2000介导pcDNA?6.2-GW/EmGFP-HIF-1αmiR干扰质粒转染急性白血病骨髓基质细胞,抗稻菌素筛选阳性克隆扩增,RT-PCR检测干扰后HIF-1αmRNA表达,从备选的3组pre-miR RNA干扰序列挑选一组有效序列进行慢病毒载体构建;3、构建针对HIF-1α的慢病毒miR RNA干扰质粒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP- HIF-1α-miR,应用脂质体Lipofectamine 2000介导联合ViraPower?混和慢病毒包装质粒转染293FT细胞产毒,产毒上清感染PT67细胞进行滴度测定。病毒感染急性白血病骨髓基质细胞,抗稻菌素筛选后,Realtime-PCR检测干扰后HIF-1αmRNA表达,western-blot检测干扰后HIF-1α蛋白表达。4、实验分组为①急性白血病基质细胞miR RNAi感染组(简称miR RNAi感染组);②急性白血病基质细胞miR-neg感染组(简称miR-neg感染组)③急性白血病基质细胞未感染组(简称未处理组)。ELISA法检测各组骨髓基质细胞培养上清VEGF、SDF-1、VCAM-1表达,MTT检测各组白血病骨髓基质细胞增殖。Jurkat细胞与各组骨髓基质细胞共培养,细胞计数法检测Jurkat细胞粘附、增殖的变化,流式细胞仪法检测Jurkat细胞细胞凋亡和细胞周期变化,Transwell法检测Jurkat细胞迁移侵袭功能变化。结果:1、急性白血病骨髓基质细胞HIF-1αmRNA表达量显著高于对照组(P<0.01);急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α、P53表达的阳性率显著高于对照组(P<0.01),急性白血病骨髓基质细胞PTEN表达阳性率显著低于对照组(P<0.01),HIF-1α与P53表达存在正性关联,与PTEN表达存在负性关联;急性白血病骨髓基质细胞SDF-1、VEGF表达显著高于对照组(P<0.01),且两种因子的高表达趋势与HIF-1α表达阳性率具有一致性。2、构建成功带有报告基因EmGFP的pcDNA?6.2-GW/EmGFP-HIF-1αmiR干扰质粒,并能成功转染急性白血病骨髓基质细胞,转染后基质细胞HIF-1αmRNA表达显著低于未转染细胞(P<0.01),提示通过miR RNA干扰法可以有效沉默基质细胞HIF-1α表达。3、构建成功针对HIF-1α的慢病毒miR RNA干扰质粒载体pLenti6/V5- GW/EmGFP- HIF-1α-miR,293FT细胞产毒后可以稳定感染急性白血病骨髓基质细胞。Realtime-PCR检测转染后急性白血病骨髓基质细胞HIF-1αmRNA显著低于未感染细胞(P<0.01),Western-blot检测感染后急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α蛋白表达显著低于未转染细胞(P<0.01),提示以慢病毒为载体的miR RNA干扰法可以有效沉默基质细胞HIF-1α表达。4、沉默HIF-1α后急性白血病骨髓基质细胞SDF-1、VEGF表达分别为3127.25±615.42pg/ml和198.32±54.69pg/ml,显著低于未处理组SDF-1、VEGF表达(4785.23±568.24pg/ml,312.55±45.68pg/ml)(P<0.01);沉默HIF-1α表达后急性白血病骨髓基质细胞贴壁增殖与未处理组无显著差异(P>0.05)。5、骨髓基质细胞与Jurkat细胞共培养3天,Jurkat细胞增殖显示:miR RNAi感染组倍增时间为50小时,低于未处理组(34小时);急性白血病骨髓基质细胞与Jurkat细胞共培养24小时,miR RNAi感染组Jurkat细胞粘附率为(28.35±5.91)%,显著低于未处理组(47.58±6.63)%(P<0.01);骨髓基质细胞与Jurkat细胞共培养72小时,miR RNAi感染组Jurkat细胞较未处理组G2/M期细胞增多(P<0.01),S期细胞比例减少(P<0.01);骨髓基质细胞与Jurkat细胞共培养72小时,miR RNAi感染组Jurkat细胞凋亡率为(17.78±4.87)%,显著高于未处理组的(6.53±3.28)%(P<0.01);骨髓基质细胞与Jurkat细胞Trnaswell培养,miR RNAi感染组Jurkat细胞穿膜细胞数为25±8 cells,显著低于未处理组(48±9)(P<0.01)。提示沉默急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α表达后,能抑制共培养的Jurkat细胞增殖、粘附和迁移侵袭能力,促进其凋亡。结论:急性白血病骨髓基质细胞存在HIF-1α高表达;构建的针对HIF-1α的miR RNAi慢病毒载体可以有效地沉默急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α表达;通过沉默急性白血病骨髓基质细胞HIF-1α表达后,可以抑制共培养的Jurkat细胞增殖、粘附和迁移侵袭能力,促进其凋亡;急性白血病骨髓基质细胞可能存在P53/PTEN→HIF-1α→VEGF/SDF-1信号通路。本研究为通过改造白血病骨髓造血微环境探索白血病的治疗提供了新的思路。