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天然橡胶作为四大工业原材料之一,在世界工业化及经济发展中起着重要的作用,是我国重要的战略物资。橡胶树（Hevea brasiliensis Muell.Arg.）、橡胶草（Taraxacum koksaghyz Rodin）、银胶菊（Parthenium hysterophorus L.）一起并称为全球三大产胶植物。目前,世界上98%的天然橡胶都来源于橡胶树。橡胶生物合成的调节是天然橡胶生产中面临的一个重大理论问题,也是科学研究的热点。乳管是橡胶树树皮中的一种分泌组织,其主要功能是合成和贮存天然橡胶。树干树皮中的次生乳管与天然橡胶生产密切相关,由维管形成层分化而来。次生乳管数量与天然橡胶产量显著正相关,是橡胶树产量育种的重要指标之一。现有的证据表明,茉莉酸（jasmonic acid,JA）是调节乳管分化的关键信号分子,而且茉莉酸信号途径参与调控天然橡胶的生物合成。橡胶草,又称俄罗斯蒲公英（Russian dandelion）,原产于哈萨克斯坦和中国的天山区域,是菊科（Composite）菊苣族蒲公英属多年生宿根型草本植物。橡胶草所产的天然橡胶为顺式聚异戊二烯,结构和性能与巴西橡胶树所产的橡胶相当。而且,从产胶的生理过程来看,有相似之处,因此橡胶草被认为是研究植物产胶机理的理想模式植物,具有很高的科学应用价值和意义。目前,由于橡胶树的遗传转化效率低,基因的功能鉴定周期长,本研究采用橡胶草悬浮细胞为材料,通过转录组测序及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术鉴定了冠菌素（coronatine,COR,一种茉莉酸类似物）响应的茉莉酸信号途径及橡胶合成途径相关基因的表达谱。同时,建立了橡胶草悬浮细胞遗传转化体系,并成功将橡胶树茉莉酸信号途径关键组分基因HbMYC2和HbMYC3转化橡胶草悬浮细胞。研究结果将为采用橡胶草悬浮细胞作为载体研究橡胶树乳管分化以及橡胶合成的机理提供参考。主要的研究结果如下:1.采用COR处理悬浮细胞8 h,进行了转录组分析,获得8.8万多个unigene。本研究随机选择了 28个unigene进行qRT-PCR分析证实转录组中数据基因表达的准确性,尽管表达量变化的倍数与数据基因表达有点偏差,但是绝大部分unigene的qRT-PCR表达趋势与数据基因表达谱是一致的。以q-value<=0.05,Fold-change（FC）>=2为标准,JA生物合成途径的相关酶的差异转录组分析结果显示,与Control相比,COR处理样品中上调的LOX基因有4个,上调的AOC基因有1个。JA信号途径差异转录组分析结果显示,与Control相比,COR处理样品有1个JAZ基因（contig5248）上调表达,log2FC值为5.94,上调表达的幅度较大;MYC基因中,有12个基因上调表达,上调幅度最高的MYC（contig7658）基因log2FC值为4.45,2个基因下调表达,1个基因仅在COR-8h样品中检测到。对JA合成及信号途径相关unigene的表达做热图,结果显示多数基因的表达受COR诱导上调表达,表明橡胶草的JA信号途径能被COR处理激活。对转录组的分析还表明,COR的处理还激活了橡胶草悬浮细胞橡胶生物合成途径上游的MVA途径以及橡胶的起始合成。结果表现为COR处理上调了 MVA信号途径中ACAT、HMGS、ZMGR、MVK基因的表达,其中,COR处理上调ACAT基因有3个,MGS基因1个,HMGR基因8个和MVK基因1个。对于橡胶合成起始阶段,GPS、FPS的表达受到了 COR处理的影响,GPS基因有1个unigene上调表达,1个基因仅在COR-8h样品中检测到表达。FPS基因有2个unigene上调表达。我们采用荧光定量PCR对已克隆的部分橡胶合成相关基因在COR处理不同时间点的悬浮细胞进行了基因表达分析结果显示,COR处理8 h显著提高了橡胶草IDI1、FPS基因的表达,且持续上调表达至三天;COR处理4 h显著提高了S PP2基因的表达,且持续上调表达至三天;COR处理3 d的显著提高了HMGR、SRPP3、SRPP4基因的表达;COR处理对GGPPS、CPT1、SRPPI基因表达的影响未达到显著水平。另外,COR是一种由丁香假单胞致病变种产生,对植物的生长呈现多种的调节功能。因此,我们对COR处理橡胶草悬浮细胞引起的其他植物信号途径也进行了分析,结果显示,COR处理能引起悬浮细胞水杨酸、乙烯、生长素以及赤霉素信号途径相关基因的响应,而且乙烯及赤霉素信号的unigene主要是以上调为主。目前,从转录组的差异表达基因中没有检测到参与脱落酸、细胞分裂素、油菜素内酯信号途径的相关基因。2.本研究测定了悬浮细胞对农杆菌抑菌剂Ticarcillin以及对潮霉素（Hygromycin B）的敏感性;采用携带pCAMBIA1302的根癌农杆菌GV3101侵染悬浮细胞,用绿色荧光蛋白（GFP）和潮霉素来检测转化的成功率。结果显示,0～300 mg/L的Ticarcillin对悬浮细胞的生长和增殖没有影响,用于进行抗性愈伤筛选的潮霉素适宜浓度为10 mg/L。抗性愈伤的绿色荧光镜检（GFP检测）以及潮霉素和GFP基因的PCR检测均表明,将OD600值为0.6的携带pCAMBIA1302农杆菌按照悬浮细胞与细胞菌液的比例为1:1.2混合侵染30 min后移至共培养基培养10d,再移至选择培养基进行筛选培养可高效获得转基因阳性的愈伤组织。3.构建pHB载体搭载HbMYC2,HbMYC3目的基因,并导入农杆菌GV3101中,侵染悬浮细胞,在筛选培养基上获得阳性愈伤,并对阳性愈伤进行了HYG,HbMYC2,HbMYC3基因的检测,确定了HbMYC2,HbMYC3过表达愈伤的获得。以无转化的橡胶草愈伤为对照,过表达橡胶树HbMYC2,HMYC3基因对FPS,CPT1,SRPP 的基因表达无影响,对HMGR,IDI1 GGPPS,SRPP1,SRPP1,SRPP2,SRPP3的表达显著下调,结果与COR诱导橡胶草悬浮细胞相关橡胶合成酶基因的表达相反,其原因有待于进一步的研究。