目的:　　 阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种发生于老年期或老年前期的以进行性记忆、认知功能障碍等为特征的慢性中枢神经系统变性疾病。越来越多的证据支持AD本质上代表一种与脑胰岛素抵抗和胰岛素缺乏有关的代谢性疾病。AD的代谢异常已经与脑胰岛素抵抗导致的信号通路紊乱联系起来，包括调控神经元存活，能量生成，基因表达和突触可塑性。研究表明，抑制胰岛素信号通过上调以下途径导致AD样神经退行性病变:1）过度磷酸化Tau蛋白的激酶活性;2）AβPP的表达和AβPP-Aβ蛋白沉积;3）氧化应激和内质网应激水平;4）产生破坏蛋白质，核糖核酸(RNA)，脱氧核糖核酸(DNA)和脂质的活性氧和活性氮物种;5）线粒体功能障碍;6）促炎症和促死亡级联的激活。　　 目前最先进的治疗缺乏答案和持续的积极成果的无奈现状，使得人们开始关注使用补充和替代医学治疗AD。不是专注于医药级，食品及药物管理局(FDA)批准的药物，而强调的是生活方式的改变，饮食，微量营养素补充剂，和消费天然化合物以防止，延缓或治疗慢性疾病。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是绿茶的一种主要多酚成分，研究证实绿茶有效的铁螯和、抗氧化、抗炎、抗癌及神经保护等作用的发挥主要依赖于EGCG。已有研究证实在外周胰岛素抵抗组织EGCG通过抗氧化、抗炎机制降低IRS-1丝氨酸磷酸化水平从而减轻胰岛素信号阻断。但EGCG对于中枢胰岛素抵抗的研究与机制探讨尚无相关报道。　　 因此，本研究以APP/PS1转基因小鼠为对象，研究了EGCG对此AD动物模型认知行为及胰岛素信号转导的影响。此外，我们采用Western blot、免疫组化、 ELISA、Real-time PCR等方法对EGCG通过改善IRS-1/PI3K/Akt信号从而减少Aβ负荷及tau蛋白磷酸化的机制进行了进一步的探讨。　　 材料与方法:　　 本实验选取以C57BL/6J小鼠为遗传背景的12月龄雌性APP/PS1(APPswe，PSEN1dE9)转基因小鼠及雌性相同月龄C57BL/6J小鼠为研究对象。EGCG溶于双蒸水，每只小鼠每天1次灌胃0.15ml，按2mg/kg或6 mg/kg体重给药。APP/PS1转基因小鼠随机分为3组（每组n=8）。(1) Tg组:每天灌胃0.15ml的双蒸水1次，连续灌胃4周;(2) Tg/EGCG-L组:每天按2 mg/kg灌胃0.04％的EGCG1次，连续给药4周;(3) Tg/EGCG-H组:每天按6 mg/kg灌胃0.12％的EGCG1次，连续给药4周。C57BL/6J小鼠(NT组，n=8)作为对照组，每天每只小鼠灌胃0.15ml的双蒸水1次，连续灌胃4周。最后1周对各组小鼠进行行为学检测，其间继续给药。行为学结束后，各组小鼠断头处死，迅速取出大脑，一半放入4％多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片用于IRS-1pSer636、IRS-1pSer312、老年斑及AT8(Anti-ptauSer202/Thr205)等指标免疫组化的检测，另一半迅速剥离海马于-70℃液氮罐中储存备用，用于Western blot印迹分析TNF-α、JNK、p-JNK、IRS-1、IRS-1pSer636、 IRS-1pSer312、IRS-1pTyr465、PI3K(p85)、Akt、p-Akt(Ser473)、IDE、 GSK3β、p-GSK3β(Ser9)、tau、 AT8(Anti-ptauSer202/Thr205)等蛋白表达水平，ELISA检测Aβ1-42水平、Real-time PCR检测IDE mRNA表达水平。　　 实验结果:　　 1、EGCG对APP/PS1转基因小鼠学习、记忆能力的影响　　 Morris水迷宫测试结果表明，与Tg组相比，Tg/EGCG-L组(2mg/kg)与Tg/EGCG-H组(6mg/kg)小鼠在定位航行（隐蔽平台）试验中寻找平台的逃避潜伏期和平均路程明显缩短(P＜0.05），在撤去平台后的空间探索试验中，停留在原平台所在目的象限的时间以及对原平台所在位置的穿梭次数均明显增加(P＜0.05），说明EGCG可以有效改善APP/PS1转基因小鼠的学习与记忆障碍。　　 2、EGCG对APP/PS1转基因小鼠海马TNF-α/JNK信号通路的影响　　 Western blot结果:Tg组小鼠海马TNF-α蛋白表达较NT组明显增加(P＜0.05）; p-JNK蛋白表达明显增加，总JNK蛋白表达水平不变，使Tg组p-JNK与总JNK蛋白比值较NT组明显增加(P＜0.01）。而Tg/EGCG-L(2mg/kg)组和Tg/EGCG-H(6mg/kg)组小鼠海马TNF-α蛋白表达较Tg组明显减少(P＜0.05); p-JNK蛋白表达明显减少，总JNK蛋白表达水平不变，p-JNK与总JNK蛋白比值较Tg组明显减少(P＜0.05）。提示EGCG可有效降低APP/PS1小鼠海马内TNF-α/JNK信号通路的异常活化。　　 3、EGCG对APP/PS1转基因小鼠海马IRS-1磷酸化的影响　　 Western blot及免疫组化结果:Tg组小鼠海马IRS-1在Ser636、Ser312这两个位点上磷酸化水平明显增加，而在Tyr465位点磷酸化水平明显减低，总IRS-1蛋白水平不变，这使Tg组IRS-1pSer636、IRS-1pSer312与总IRS-1蛋白比值较NT组明显增加(P＜0.05），IRS-1pTyr465与总IRS-1蛋白比值较NT组明显减低（P＜0.01）。 Tg/EGCG-L(2mg/kg)组和TgEGCG-H（6mg/kg）组小鼠海马IRS-1 Ser636、IRS-1 Ser312磷酸化水平明显降低，IRS-1Tyr465磷酸化水平明显升高，使EGCG各干预组IRS-1pSer636、IRS-1pSer312与总IRS-1蛋白比值较Tg组明显降低(P＜0.05），IRS-1pTyr465与总IRS-1蛋白比值较Tg组明显升高(P＜0.05），提示EGCG治疗可减轻IRS-1信号阻断，改善脑胰岛素抵抗状态。　　 4、EGCG对APP/PS1转基因小鼠海马PI3K/Akt信号通路的影响Western blot结果:Tg组小鼠海马PI3K(p85)蛋白表达较NT组明显减少(P＜0.05);p-AktSer473蛋白表达明显减少，总Akt蛋白表达水平不变，使Tg组p-AktSer473与总Akt蛋白比值较NT组明显降低(P＜0.05）。而Tg/EGCG-L(2mg/kg)组和Tg/EGCG-H(6mg/kg)组小鼠海马PI3K(p85)蛋白表达较Tg组明显增加(P＜0.05); p-AktSer473蛋白表达明显增加，总Akt蛋白表达水平不变，p-AktSer473与总Akt蛋白比值较Tg组明显增加（P＜0.05）。提示EGCG可有效改善APP/PS1小鼠海马内PI3K/Akt信号通路的活化抑制。　　 5、EGCG对APP/PS1转基因小鼠海马IDE mRNA及蛋白表达的影响　　 Real-Time PCR及Western Blot结果显示:与NT组相比，Tg组小鼠海马IDEmRNA水平、蛋白表达明显降低(P＜0.01);Tg/EGCG-L(2mg/kg)组和Tg/EGCG-H(6mg/kg)组小鼠海马IDE mRNA水平、蛋白表达较Tg组明显升高(P＜0.05）。提示EGCG干预可以升高APP/PS1小鼠海马内的IDE表达水平。　　 6、EGCG对APP/PS1转基因小鼠海马Aβ1-42水平及老年斑的影响　　 ELISA结果显示:Tg组小鼠海马可溶性及不可溶性Aβ1-42含量较NT组明显增高(P＜0.01); Tg/EGCG-L(2mg/kg)组和Tg/EGCG-H(6mg/kg)组小鼠海马可溶性及不可溶性Aβ1-42含量较Tg组明显降低(P＜0.05）。提示EGCG干预可有效减少APP/PS1小鼠海马内Aβ1-42含量。　　 Aβ免疫组织化学染色结果显示:与NT组相比，Tg组小鼠海马区域中的老年斑块数量明显增多，着色较深、斑块体积增大(P＜0.01）。Tg/EGCG-L（2mg/kg）组和Tg/EGCG-H(6mg/kg)组小鼠海马区域内的老年斑数量和老年斑相对面积较Tg组明显减少(P＜0.05）。提示EGCG干预可有效减轻APP/PS1小鼠海马内Aβ斑块沉积。　　 7、EGCG对APP/PS1转基因小鼠海马GSK3β活性的影响　　 Western Blot结果显示:与NT组相比，Tg组小鼠海马p-GSK3β(Ser9)蛋白表达明显减少，总GSK3β蛋白表达水平不变，这使Tg组p-GSK3β(Ser9)与总GSK3β蛋白比值较NT组明显降低(P＜0.05); Tg/EGCG-L（2mg/kg）组和Tg/EGCG-H(6mg/kg)组小鼠海马p-GSK3β(Ser9)蛋白表达明显增加，总GSK3β蛋白表达水平不变，这使EGCG各干预组p-GSK3β(Ser9)与总GSK3β蛋白比值较Tg组明显升高（P＜0.05），提示EGCG干预可有效抑制APP/PS1小鼠海马内GSK3β的激活。　　 8、EGCG对APP/PS1转基因小鼠海马内tau蛋白Ser202/Thr205位点磷酸化的影响　　 Western Blot及免疫组化结果显示:与NT组相比，Tg组小鼠海马tau蛋白在Ser202/Thr205位点磷酸化水平显著上升，总tau蛋白表达水平无明显差异。这使Tg组p-tau(Ser202/Thr205)与总tau蛋白比值较NT组明显增加(P＜0.01）;而Tg/EGCG-L(2mg/kg)组和Tg/EGCG-H(6mg/kg)组小鼠治疗4周，海马tau蛋白Ser202/Thr205位点磷酸化水平明显降低，总tau蛋白表达水平无明显差异。这使EGCG各干预组p-tau(Ser202/Thr205)与总tau蛋白比值较Tg组明显降低(P＜0.05)，提示EGCG治疗可逆转APP/PS1小鼠海马tau蛋白在Ser202/Thr205位点的过度磷酸化状态。　　 结论:　　 1、EGCG可以明显改善APP/PS1转基因小鼠的空间学习记忆能力。　　 2、EGCG可明显降低APP/PS1转基因小鼠海马TNF-α/JNK信号通路活化。　　 3、EGCG可显著减轻APP/PS1转基因小鼠海马IRS-1Ser636、312位点磷酸化，增加IRS-1Tyr465位点磷酸化，改善IRS-1信号传导。并且其作用机制可能与其降低TNF-α/JNK信号通路的活化相关。　　 4、EGCG可显著上调APP/PS1转基因小鼠海马IRS-1信号传导下游PI3K/Akt通路的活性。　　 5、EGCG可通过活化PI3K/Akt信号通路，上调APP/PS1转基因小鼠海马IDEmRNA及蛋白表达水平，增强Aβ清除，减少此模型海马Aβ1-42水平及淀粉样斑块沉积。　　 6、EGCG可通过活化PI3K/Akt信号通路，抑制APP/PS1转基因小鼠海马GSK3β活性，减轻tau蛋白在Ser202/Thr205位点的过度磷酸化状态。