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一研究目的肝纤维化为诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组织学变化，是影响慢性肝病预后的重要环节，在尚无有效方法根治原发疾病的情况下，减缓或阻止肝纤维化进程是相当重要的治疗对策。在我国，病毒性肝炎、血吸虫病和酒精性肝病是引起慢性肝病的三大主要病因。根据1992年全国病毒性肝炎血清流行病学调查，我国人群中HBsAg阳性率平均为9.75％，约为1亿2千万人，占世界HBV感染人数的1／3。其中慢性肝炎患者约有3千万人，这些患者均有可能或已经发展为肝纤维化。因此肝纤维化的群体是十分巨大的，所以寻找治疗肝纤维化的有效方法就显得十分迫切而必要。在治疗方面，目前西医治疗肝纤维化尚无具有特异性疗效的方法，而中医药却在治疗肝纤维化上表现出独特的优势，逆纤方由白花蛇舌草、丹参、山药、旱莲草、太子参、白芍等11味中药组成，具有清热解毒、扶正活血化淤的作用。在以往的实验研究中证实其具有确切的抗HBV、保护肝损伤的作用。本实验采用二甲基亚硝胺（DMN）建立肝纤维化动物模型，研究中药复方逆纤方治疗大鼠实验性肝纤维化的分子机制，为中医药治疗肝纤维化提供理论依据。二研究方法实验主要包括三个部分：1、逆纤方抗肝纤维化的体内外实验研究动物实验选用SPF级SD大鼠100只，对94只大鼠进行造模，另外6只作为空白对照。用生理盐水配制1：100（V／V）的DMN稀释溶液，每周前3天对大鼠进行腹腔注射，剂量为10μL DMN／Kg体重，空白对照组同时腹腔注射生理盐水，共注射4周，每周第1天记录大鼠体重变化。第4周注射结束后随机分为模型对照组、鳖甲软肝片组、逆纤方水提大剂量组、逆纤方水提小剂量组、逆纤方醇提大剂量组、逆纤方醇提小剂量组，除模型组14只外，其余各组均为12只。鳖甲软肝片组以2g／Kg体重灌胃，逆纤方水提大、小剂量组分别以30g／Kg、15 g／Kg体重灌胃，醇提大、小剂量组亦分别以30g／Kg、15g／Kg体重灌胃，模型及空白对照组均用生理盐水灌胃10ml／Kg。所有大鼠均每天称体重并灌胃，共灌胃21天。从造模开始到实验结束详细记录大鼠的死亡情况。实验结束时用速眠新腹腔注射麻醉大鼠后摘眼球取血收集血清，肉眼观察腹水多少、清晰度、性质及肝脏形态、颜色，并取左前叶肝脏，部分置于Bouin液固定，进行HE染色、Masson染色及a-SMA、Ⅰ型胶原免疫组化。用HSC-T6细胞作为体外模型，将逆纤方药物原液倍比稀释成10个浓度进行上药，丹参注射液作为阳性对照药物倍比稀释7个浓度上药，用MTT法检测药物细胞毒性，计算细胞TC50，评价逆纤方对HSC增殖的抑制作用。2、逆纤方对肝纤维化大鼠及体外培养的HSC Fas／FasL mRNA表达的影响本实验部分拟在实验一的基础上，从HSC细胞凋亡着手，进一步探讨逆纤方抗肝纤维化的机制。采用Annexin V／PI双染结合流式细胞仪检测HSC凋亡情况。同时运用实时荧光定量PCR的方法，对大鼠肝组织及体外培养的HSC-T6细胞Fas／FasL mRNA的表达进行相对定量。3、逆纤方对HSC-T6细胞uPA、PAI-1、TIMP-1及MMP-13 mRNA表达的影响实验三从uPA纤溶系统出发，用免疫组化法检测肝纤维化大鼠肝组织中uPA和PAI-1蛋白的表达并观察逆纤方的调控作用；同时运用实时荧光定量PCR方法，对体外培养的HSC-T6细胞uPA、PAI-1、TIMP-1及MMP-13 mRNA表达进行相对定量，初步探讨uPA纤溶途径与肝纤维化的关系及逆纤方的调节作用。三实验结果1、逆纤方抗肝纤维化的体内外实验研究对DMN诱导的大鼠肝纤维化模型，逆纤方水提大、小剂量组均可降低大鼠血清HA、LN、CⅣ、PCⅢ和肝组织HyP含量，大剂量组优于小剂量组；醇提大、小剂量组血清HA、PCⅢ、LN、CⅣ及HyP水平下降不明显；而鳖甲软肝片组可降低各项血清学指标，但效果不及逆纤方水提大、小剂量组。病理结果HE染色显示，正常对照组大鼠肝脏结构完整，模型对照组可见肝小叶失去正常结构，胶原纤维沿界板破坏处向肝小叶内延伸，多数形成假小叶，所有切片均可见程度不等、范围不一的肝组织坏死区、多发出血灶，中央或局部有炎性细胞浸润；逆纤方水提大剂量组肝小叶结构破坏不明显，有2个标本大量纤维沉积于汇管区，其中1个形成假小叶，其余可见纤维条索，大部分肝细胞排列整齐，所有标本均有少量炎细胞浸润；逆纤方水提小剂量组标本也可见汇管区纤维沉积，有炎细胞浸润，肝细胞排列紊乱；逆纤方醇提大剂量组所有标本可见汇管区大量纤维沉积，肝细胞排列不整齐，炎细胞浸润，3个标本有出血灶；逆纤方醇提小剂量组也可见汇管区纤维沉积，有炎细胞浸润，肝细胞排列紊乱。体外实验显示，在药物作用24h后，逆纤方对HSC-T6的半数毒性浓度TC50为62.15mg／ml，阳性对照药丹参注射液的半数毒性浓度TC50为1：10的稀释浓度；在药物作用24h后，逆纤方及丹参注射液对HSC-T6均表现出较强的的抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑制作用有所增强，说明逆纤方及丹参注射液对HSC-T6的抑制作用有一定的量效依赖关系。结果提示，逆纤方抗肝纤维化的作用与其抑制HSC的增殖有关。2、逆纤方对肝纤维化大鼠及体外培养的HSC-T6 Fas／FasL mRNA表达的影响流式细胞细胞凋亡的检测结果显示，细胞对照组凋亡率为0.8％，逆纤方30mg／ml剂量组凋亡率为75.4％，15mg／ml剂量组凋亡率为10.9％，丹参注射液1：20浓度组凋亡率为7.6％，1：40浓度组凋亡率为2.8％。实时荧光定量PCR结果分析显示，与模型对照组相比，逆纤方水提大剂量组大鼠肝组织Fas／FasL基因mRNA的表达有明显上调；逆纤方水提小剂量组也可调节Fas／FasL基因mRNA的表达，但上调水平不及大剂量组；逆纤方醇提大、小剂量组Fas／FasL基因mRNA的表达量与模型对照组相比无统计学意义。体外实验，与细胞对照组比较，丹参注射液各浓度组及逆纤方高、低剂量组均可调节Fas／FasL基因的表达（P＜0.05或P＜0.01），逆纤方30mg／ml剂量组对Fas／FasL基因的表达调节优于其它各组。3、逆纤方对HSC-T6细胞uPA、PAI-1、TIMP-1及MMP-13 mRNA表达的影响体内免疫组化结果显示，逆纤方水提大剂量组，uPA表达较其他各组明显增多，PAI-1仅在4个样本中散在表达；水提小剂量组uPA表达明显低于水提大剂量组，PAI-1则每个样本均有表达；鳖甲软肝片组uPA有阳性表达，但低于水提小剂量组，PAI-1则每个样本均有表达。醇提大剂量组则以PAI-1表达最为明显，醇提小剂量组uPA表达高于醇提大剂量组。实时荧光定量PCR结果提示，与细胞对照组比较，丹参各浓度组及逆纤方30mg／ml、15mg／ml剂量组均可调节uPA、PAI-1、TIMP-1及MMP-13 mRNA的表达（P＜0.05或P＜0.01）。逆纤方30mg／ml剂量组对上述基因的表达调节优于其它各组，且表现出一定的剂量依赖性。四结论1、逆纤方能够降低DMN致实验性肝纤维化大鼠血清肝纤维化指标及肝组织HyP含量，组织病理学显示其能够，减轻肝脏功能损伤，逆转肝脏纤维化进程。对体外培养的HSC-T6细胞增殖有明显的抑制作用，且表现出一定的量效依赖关系；2、逆纤方可通过Fas／FasL系统诱导HSC凋亡，30mg／ml浓度组诱导能力优于15mg／ml剂量组；3、逆纤方可通过调节uPA纤溶途径，间接调节MMPs的活性，促进ECM降解，逆转肝纤维化。