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近年来,乳腺炎的发病率依然很高,且很难治愈,给我国奶牛养殖业造成巨大的经济损失。当病原体侵入乳腺可引发机体启动系列免疫和炎症变化,通过复杂的基因表达调控响应炎症反应。本实验室前期通过RNA-seq技术发现CCL5基因在乳腺炎乳腺组织的表达量显著高于在健康乳腺组织中的表达量(P<0.05)。已有研究表明CCL5基因与免疫相关。鉴于此,本研究将CCL5作为乳腺抗性相关的候选基因,分别从启动子、可变剪接和microRNA角度探讨其差异表达的转录水平和转录后水平上的分子调控机制。同时,鉴定与乳房炎抗性相关的功能性单核苷酸多态(SNP)标记。主要研究结果分述如下:1.CCL5基因可变剪切体及功能性SNPs的鉴定可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制。我们在奶牛乳腺组织中检测到CCL5基因的一个可变剪切体(CCL5-AS)。通过DNA sanger测序鉴定了CCL5基因CDS区的两个SNP(g.1647 C>T和g.1804 G>A),但细胞水平实验发现它们不会导致产生可变剪切,其具体调控机制需进一步研究。2.CCL5基因启动子活性分析及功能性SNPs的鉴定启动子是调控基因转录的重要组件。通过Genomatix软件预测CCL5基因的启动子区域位于(g.-1300bp~g.+172bp),在CCL5基因启动子区鉴定了一个SNP(g.-727 T>A),双荧光素酶报告基因活性检测表明突变型(TT)的启动子活性显著高于野生型(AA)(P<0.05)。在中国荷斯坦奶牛群体中对该SNP位点的基因型与体细胞评分(SCS)进行关联分析,发现该位点TT个体的SCS值显著高于AA个体值(P<0.05)。3.影响bta-miR-2295与靶标CCL5靶结合能力的功能性SNPs的鉴定MicroRNA能够通过与其靶基因3’UTR结合调控基因表达。通过RNA22和RNAhybrid软件预测发现bta-miR-2295可以与CCL5基因3’UTR结合。在CCL5基因3’UTR发现一个SNP(g.7413 G>A)。将野生型(GG)和突变型(AA)的3’UTR片段连接到pMIR报告载体中,与bta-miR-2295表达载体pEZX共转染细胞,通过双荧光素酶活性分析,发现bta-miR-2295可使荧光素酶报告基因表达量显著降低,这说明bta-miR-2295可与CCL5基因的3’UTR结合抑制基因表达。在中国荷斯坦奶牛群体中对该SNP位点的基因型与体细胞评分(SCS)进行关联分析,发现GG个体的SCS值显著高于AA个体的SCS值(P<0.05)。