布鲁菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性菌,根据其表型,可分为光滑型和粗糙型布鲁菌。布鲁菌无经典的毒力因子,其毒力主要体现在宿主细胞内寄生和存活、逃逸宿主免疫应答、抑制细胞凋亡、在宿主体内建立慢性感染的能力。因此,布鲁菌毒力基因的鉴定和功能研究具有重要意义。研究表明,光滑型布鲁菌在感染过程中,小部分布鲁菌可自发突变为粗糙表型并诱导巨噬细胞死亡,该特征对于布鲁菌在细胞间扩散和再感染至关重要。但粗糙型布鲁菌感染致死细胞的分子机制目前并不完全清楚。在本研究中,我们以布鲁菌rfbE基因缺失株(粗糙型布鲁菌突变株,以下称为RB14株)为模式菌株,探讨粗糙型布鲁菌感染致死巨噬细胞的分子机制。首先,验证了 RB14感染致死巨噬细胞依赖于布鲁菌Ⅳ型分泌系统(T4SS)。为进一步验证巨噬细胞死亡依赖于布鲁菌T4SS结构组分还是分泌活性,我们构建了两个仅影响T4SS分泌活性,而不影响T4SS组分表达的T4SS VirB4和VirB11 ATP结构域突变株用于研究。细胞毒性分析表明,RB14诱导的巨噬细胞死亡依赖于T4SS的分泌活性。在进一步研究中,我们使用过表达和转染方法评估了15个已报道的T4SS效应蛋白在细胞毒性中的作用,结果表明,15个效应蛋白过表达株均无细胞毒性。此外,选取其中的10个效应蛋白单独转染或五个效应蛋白共转染均无细胞毒性,结果预示,已报道的15个效应蛋白与RB14感染致死巨噬细胞无关。我们还评估了内质网压力应激IRE1α通路、Txnip-和Caspase-2蛋白在RB14诱导巨噬细胞死亡中的作用。结果表明,IRE1α激活、Caspase和Caspase-2激活与RB14感染致死巨噬细胞无关。同时,RB14感染casp2和txnip基因敲除细胞与亲本细胞相比呈现相似的致死特性。总之,RB14感染致死巨噬细胞依赖于T4SS的分泌活性,且与巨噬细胞IRE1α、Txnip、Caspase-2介导的信号通路无关。在前期研究中,我们新发现一个流产布鲁菌DeoR家族转录调控子与细菌毒力相关,将该基因命名为vdtR基因。在本研究中,我们成功构建了流产布鲁菌vdtR基因缺失株ΔvdtR和原位回复株△vdtR-Rev。基本表型分析发现,vdtR缺失不影响布鲁菌LPS结构和生长特性;耐受性试验发现,vdtR缺失不影响布鲁菌抵抗氧化应激、氮化应激、阳性杀菌肽和自然血清的杀伤。细胞感染试验发现,ΔvdtR缺失株显著减弱胞内存活能力,间接免疫荧光试验分析发现,△vdtR缺失株显著减弱布鲁菌逃逸溶酶体降解及转运至内质网形成成熟复制小体的能力。动物感染试验发现,ΔvdtR缺失株感染小鼠的脾脏载菌量显著低于野生株,预示VdtR在布鲁菌感染致病过程中发挥重要的调控作用。为探讨其调控的分子机制,后续研究中我们基于细菌转录组学比较分析野生株和△vdtR缺失株差异转录基因。经qPCR验证发现,VdtR调控7个关键靶基因的表达,包括BAB_RS27025-55基因簇6个基因和BAB_RS27060基因,RT-PCR分析发现BAB_RS27025-55基因簇具有共转录现象。之后,通过LacZ报告基因分析启动子活性显示,仅BAB_RS27055基因启动子依赖于VdtR蛋白的表达,结果预示,VdtR蛋白通过调控BAB_RS27025-55基因簇同一操纵子发挥调控作用。为验证VdtR的直接调控作用,我们通过EMSA试验分析发现,VdtR蛋白可以直接结合BAB_RS27055基因的启动子区。为进一步探讨VdtR的功能,在布鲁菌胞内感染状态下基因转录分析发现,BAB_RS27025-55基因簇呈现显著的下调表达,且验证了胞内布鲁菌基因簇的表达同样依赖于VdtR蛋白,vdtR缺失后,布鲁菌BAB_RS27025-55基因簇不能被抑制表达,呈现整体上调表达的趋势。综上所述,VdtR在调控布鲁菌致病过程中发挥重要作用,与布鲁菌逃逸溶酶体降解,形成成熟复制小体相关,发现了其抑制表达的关键基因簇,预示该基因簇参与的代谢在布鲁菌胞内存活中发挥重要作用。本研究为布鲁菌致病机制研究提供新思路。