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背景和目的牙周炎、骨折、畸形和手术切除肿瘤等多种原因会造成骨组织的缺损,这些骨缺损影响组织的正常结构和功能,因此促进缺损骨组织的再生在临床治疗中具有重要意义。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在组织修复与伤口愈合中的治疗作用已得到了广泛的认可,然而直接移植的MSCs具有移植性差、寿命相对较短以及移植的MSCs可能的致瘤作用等局限性,且有研究者证明MSCs可能通过旁分泌作用调节病变部位的微环境,从而促进损伤部位的修复与再生,因此间充质干细胞旁分泌的条件培养基(conditioned medium,CM)似乎是MSCs的有前景的替代疗法。血管生成在组织修复和再生中起着重要作用,促进血管生成能够加速骨组织的再生。源自间充质干细胞的条件培养基(conditioned medium derived from mesenchymal stem cells,MSC-CM)具有促血管生成的能力,但是MSC-CM中生长因子的种类有限且浓度较低,不能满足组织再生的需求,有待优化。慢病毒转染技术通过改善细胞原有的基因组序列,改变细胞分泌因子的种类和数量。成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)已被证明是有效的血管生成因子,其不仅自身具有促进细胞增殖,维持间充质干细胞干性的能力,还可以促进其他促血管生成相关因子(如VEGF-A)的表达。因此,本研究期望通过FGF-2基因的过表达优化来自人牙龈间充质干细胞(human gingival MSCs,hGMSCs)的 CM(hGMSC-CM),从而获得具有促进血管生成的优化条件培养基。材料与方法1.人牙龈间充质干细胞的分离、培养及鉴定组织块酶消法分离培养、单克隆获取并提纯hGMSCs。克隆形成率检测评价其增殖效率;细胞流式术鉴定干细胞表面标志物;成骨、成脂诱导染色鉴定其多向分化潜能。2.过表达FGF-2基因的人牙龈间充质干细胞的构建及鉴定利用慢病毒转染技术构建过表达FGF-2基因的hGMSCs(称之为LV-FGF-2+-hGMSCs)及其对照细胞(LV-vector+-hGMSCs),荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达并采用qRT-PCR技术检测FGF-2基因的表达量。3.LV-FGF-2+-hGMSC-CM的获取及促血管形成相关因子(FGF-2、VEGF、TGF-β)的检测使用不含血清的DMEM培养基孵育LV-FGF-2+-hGMSCs,提取上清液,使用截流值为10KDa的超滤离心管浓缩获得LV-FGF-2+-hGMSC-CM。ELISA技术检测 FGF-2、VEGF-A、TGF-β的浓度。4.体外检测LV-FGF-2+-hGMSC-CM对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的迁移作用和血管形成作用的影响(1)qRT-PCR和western blot检测HUVECs中血管形成相关标志物(PLGF、SCF、VEGFR2)的基因和蛋白的表达量;细胞免疫荧光技术检测VEGFR2的表达量。(2)成管实验检测LV-FGF-2+-hGMSC-CM对HUVECs的血管形成作用。(3)使用Transwell小室进行细胞迁移实验,检测LV-FGF-2+-hGMSC-CM对HUVECs的迁移作用5.小鼠体内检测LV-FGF-2+-hGMSC-CM对HUVECs血管形成能力的影响将基质胶分别与 HUVECs、HUVECs 和 hGMSC-CM、HUVECs 和LV-FGF-2+-hGMSC-CM进行充分混匀后注入NOD-SCID小鼠皮下(基质胶为对照组),7天后取出基质胶材料,通过改良CD31免疫组化方法检测CD31阳性表达量并进行统计学分析。结果1.结晶紫染色结果显示,hGMSCs的克隆形成率为42.7%;流式细胞术检测结果显示hGMSCs表面较高水平的表达干细胞表面标志物CD44(100%)、CD90(99.9%)和CD105(99.4%),而较低水平的表达造血干细胞表面标志物CD34(5.8%)和CD45(0.7%);成骨诱导21天后,hGMSCs形成明显的矿化结节;成脂诱导21天后,hGMSCs形成明显的红色脂滴。2.当MOI=40时,慢病毒感染的hGMSCs在荧光显微镜下观察到较强的绿色荧光。qRT-PCR结果显示,实验组FGF-2的基因表达量较空载组和正常细胞组显著升高。3.使用截流值为10KDa的超滤离心管将上清液浓缩约50倍后获得CM。ELISA检测结果表明,与空载组和正常细胞组相比,实验组CM中含有更多的FGF-2、VEGF-A 和 TGF-β。4.(1)qRT-PCR 和 western blot 的结果显示,LV-FGF-2+-hGMSC-CM 组中血管形成相关标志物(PLGF、SCF、VEGFR2)的基因和蛋白表达量较ECM组、hGMSC-CM组、LV-vector+-hGMSC-CM组显著增高。细胞免疫荧光结果同样显示:LV-FGF-2+-hGMSC-CM组的VEGFR2的表达量明显多于ECM组、hGMSC-CM 组、LV-vector+-hGMSC-CM 组。(2)成管实验结果显示,培养HUVECs 24h时,LV-FGF-2+-hGMSC-CM组的成管总长度及管分叉总长度明显长于hGMSC-CM组和LV-vector+-hGMSC-CM组。(3)Transwell迁移实验结果显示,LV-FGF-2+-hGMSC-CM组迁移细胞的数量明显多于空载组、正常细胞组和阴性对照组。5.改良CD31免疫组化结果显示:基质胶注入小鼠背部皮下7天后,LV-FGF-2+-hGMSC-CM组基质胶栓中的CD31表达量明显高于hGMSC-CM组。结论FGF-2基因的过表达可以促进hGMSCs旁分泌更多的血管生成相关的生长因子,从而可以获得促进血管生成的优化条件培养基。