【摘 要】
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目的:血红蛋白H病（hemoglobin H disease,Hb H病）是由α-基因缺陷所导致的α-珠蛋白与β-珠蛋白失衡所引来的,减少相对过剩的β-珠蛋白的生成是治疗Hb H病的关键。我们通过研究靶向β-珠蛋白链m RNAR的siRNA对体外定向分化培养的红系细胞β-珠蛋白的调控作用,为Hb H病的基因治疗提供新的理论支持。方法:1.建立红系细胞的体外分化培养体系,我们通过磁珠分选方法分选人的
【基金项目】
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国家自然科学基金:腺相关病毒载体（AAV）介导高表达Hepcidin治疗非输血依赖性地中海贫血鼠模型铁过载的作用及机制,项目合同编号:81460025,项目起止时间:2015年1月~2018年12月
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目的:血红蛋白H病（hemoglobin H disease,Hb H病）是由α-基因缺陷所导致的α-珠蛋白与β-珠蛋白失衡所引来的,减少相对过剩的β-珠蛋白的生成是治疗Hb H病的关键。我们通过研究靶向β-珠蛋白链m RNAR的siRNA对体外定向分化培养的红系细胞β-珠蛋白的调控作用,为Hb H病的基因治疗提供新的理论支持。方法:1.建立红系细胞的体外分化培养体系,我们通过磁珠分选方法分选人的CD34+造血干细胞,通过流式细胞术检测细胞分选纯度,在二阶段培养体系中对其进行扩增及向红系定向分化培养,培养过程中定期在显微镜下进行形态学观察及通过流式细胞术检测红系细胞表面标记物CD71与CD253a的表达情况。2.筛选最佳的靶向β-珠蛋白链m RNA的siRNA,将100 pmol的siRNA1、siRNA2、siRNA3通过电穿孔技术分别转染至3组细胞内作为实验组,0 pmol作为空白对照组,100 pmol siRNA-nge作为阴性对照组,RT-PCR（Real time-PCR）检测红系细胞β珠蛋白基因的表达水平,筛选出对β-珠蛋白基因表达下调作用最佳的组。3.筛选siRNA最佳剂量,将0 pmol、50 pmol、100 pmol、150 pmol、200 pmol的最佳siRNA序列别作用于红系细胞,利用RT-PCR检测红系细胞β-珠蛋白基因的表达水平,筛选出最佳剂量,通过Western bloting实验检测最佳siRNA序列对β-珠蛋白的调控作用。并通过流式细胞术检测siRNA对细胞的毒性。4.将筛选出来的最佳siRNA序列以有效浓度作用于血红蛋白H病红系细胞,检测siRNA对细胞β-珠蛋白基因调控作用,比较正常红系细胞与Hb H病红系细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平,以及转染siRNA后这两种细胞内ROS水平的变化,并检测细胞的凋亡率,综合评估转染siRNA对Hb H病红系细胞的影响。结果:1.经磁珠分选的CD34+造血干细胞具有高纯度,在二阶段培养体系中CD34+造血干细胞逐步可分化为成熟红细胞。2.siRNA2是抑制红系细胞β-珠蛋白基因表达的最佳序列（P<0.05）。3.在48小时内,不同浓度的siRNA2均可下调红系细胞β-珠蛋白基因的表达水平（P0.05）,高剂量组的沉默效应更显著,沉默效应持续的时间也更长,200 pmol的siRNA2在转染后96小时内均可下调人红系细胞β-珠蛋白（P<0.05）,且无明显增加细胞的凋亡率。4.siRNA2对Hb H病红系细胞β-珠蛋白的m RNA有调控作用（P<0.05）。5.正常红系细胞内的ROS明显少于Hb H病红系细胞（P<0.01）,转染siRNA2后正常红系细胞内的ROS增加（P<0.01）,与之相反,Hb H病红系细胞内的ROS减少（P<0.01）。6.转染siRNA2可减轻Hb H病红系细胞的凋亡率,其中转染后72小时的早期凋亡率与总凋亡率下降有统计学意义（P<0.05）。结论:1.本研究证明靶向β-珠蛋白链RNA的siRNA对体外定向分化培养的人红系细胞β-珠蛋白有调控作用,siRNA的基因沉默效应和效应持续时间均与作用剂量有关。2.靶向性siRNA可下调Hb H病红系细胞内β-珠蛋白m RNA的表达水平并可以减少细胞内ROS的产生和细胞凋亡率,这将有助于减轻Hb H病红细胞溶血,改善临床贫血症状,可成为Hb H病的临床治疗新途径。
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