藻类热激蛋白系统进化研究及三种紫菜HSP70基因的克隆与表达

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热激蛋白70(HSP70,heat shock protein70)是生物体内分布最广,进化上最保守的一类热激蛋白。植物HSP70主要介入新生蛋白的折叠与成熟、受损蛋白的降解和蛋白的运输,同时HSP70在海藻的发育、抗病性及非生物胁迫的响应方面都起着重要作用。定生于中潮带和上潮带的大型海藻,周期性的经历海水和空气两种截然相反的环境条件的变化,面对失水、高渗、强光等诸多极端环境因子的强烈胁迫,而藻类有多种应对环境胁迫的保护机制,其中热激蛋白(HSPs)在藻类抗逆过程中起着重要作用。  目前,由于大型藻类中还存在许多未证实的HSPs基因,利用生物信息学方法对HSPs基因家族进行鉴定分析。以藻类基因组为主体,统计出不同藻类中热激蛋白基因家族总数、亚家族数量,制作统计表;利用NCBI中古菌、蓝细菌、真菌、藻类、高等植物HSPs基因,以包括NCBI和大型海藻转录组(IKP计划)中的基因组(包括后生动物、维管植物、蓝细菌、卵菌、定鞭藻、轮藻、棕色藻、红藻、隐藻、灰色藻、甲藻、绿藻、褐藻基因组)为主,进行Blast,筛选目的序列,对不同热激蛋白家族,构建系统发育树,以类群(门、纲)为单位,研究不同热激蛋白家族基因的分布、起源、进化,进一步探索藻类中的HSPs的功能,为研究藻类抗胁迫机制奠定基础。  紫菜对于抗逆胁迫的良好生物学特性,已有大量研究报道了条斑紫菜和坛紫菜两种紫菜的HSP70在抗逆胁迫过程中的转录表达情况,并推测其在抗逆过程中发挥了重要的作用。坛紫菜(Pyropia haitanensis)、长紫菜(P.dentata)和皱紫菜(P.crispata)是南方常见的野生种类,生长于中高潮带岩礁,具有较高的药用价值和经济价值。目前,已有从光合生理和生化组成上研究了三种紫菜在高温胁迫下具有不同的抗性。本文则从分子水平揭示三种紫菜的耐热机制,探究三种紫菜的耐高温能力,为紫菜的栽培生产提供科学指导。主要研究结果如下:  1.统计不同藻类中热激蛋白基因家族总数,对不同热激蛋白家族,构建系统发育树,探究热激蛋白基因在藻类中的进化情况。  2.为进一步探讨HSP70基因的生物学作用及其在系统进化方面的保守性,采用RACE的方法,克隆了坛紫菜、长紫菜和皱紫菜HSP70基因序列:PhHsp70、PdHsp70、PcHsp70,其基因全长分别为2152bp、2137bp、2150bp。编码区均包含1866bp,共编码621个氨基酸,与同属紫菜HSP70的氨基酸一致性达90%以上。  3.三种紫菜分别在22℃、27℃、31℃下处理0、10min、30min、1h、6h、12h、18h、24h、35h,利用Real-time PCR技术研究在不同温度胁迫下HSP70基因的表达情况,进而去探究海藻在温度的刺激下机体耐温的相关分子机制,HSP70基因在三种紫菜中的表达水平变化趋势基本一致,均呈现先上调后下调,随后稍上调再下调的趋势。皱紫菜在31℃高温胁迫10min即可检测到表达水平显著上调至最高水平,长紫菜和坛紫菜31℃热激时均于1h表达量达到最高水平。
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