在现代集约化养殖中,为提高反刍动物的生产性能及生产效率,生产者往往采用高谷物日粮的饲喂模式。与以粗饲料为主的日粮相比,高谷物日粮在瘤胃内被瘤胃微生物快速发酵,导致瘤胃内VFA累积和pH值降低。为适应上述瘤胃内环境的变化,绵羊瘤胃生理结构会发生相应改变。然而,目前人们对于瘤胃上皮对高谷物日粮的适应性机制仍不清楚。因此,本论文从组织、细胞和分子层面,系统研究了绵羊瘤胃上皮对持续性饲喂高谷物日粮的适应机制,并探索此适应性过程中瘤胃上皮生长的细胞信号传导机制。1.绵羊瘤胃上皮对高谷物日粮的形态适应性研究本章旨在研究绵羊瘤胃上皮对高谷物日粮的形态适应性。试验选用20头绵羊（体重25.60±0.41 kg,180日龄左右）,随机分为4组,每组5头。根据饲喂高谷物日粮的持续时间不同,4组分别为CON组（对照组,饲喂干草）、G7组（饲喂高谷物日粮7天）、G14组（饲喂高谷物日粮14天）和G28组（饲喂高谷物日粮28天）。预饲期为28天,正式试验期为28天,分别于高谷物饲喂后7天、14天、28天屠宰各组,采集绵羊瘤胃液及瘤胃上皮组织样品进行分析。结果发现,饲喂高谷物日粮28天时（G28组）绵羊日增重显著高于G7组（P=0.015）。G7、G14和G28三组间绵羊的干物质采食量无显著差异（P=0.367）。G14组的瘤胃干重占体重比显著高于CON组（P=0.018）。随着高谷物日粮饲喂时间的延长,瘤胃液pH值（P<0.001）呈线性降低,而TVFA（P=0.001）和丁酸（P<0.001）呈线性增加,而戊酸浓度（P=0.029）呈二次方影响。与对照组比较,饲喂高谷物日粮14天后,瘤胃上皮乳头的长度（二次方,P=0.004）、宽度（三次方,P=0.015）和表面积（线性,P=0.003）均显著增加。随着高谷物日粮饲喂时间的延长,瘤胃上皮角质层细胞层数（P<0.001）、角质层厚度（P<0.001）、颗粒层/棘突层厚度（P<0.001）和基底层厚度（P=0.028）均呈三次方变化。结果说明,饲喂高谷物日粮改变了绵羊瘤胃发酵模式,增加了 TVFA产量,绵羊瘤胃上皮可通过形态学的改变来适应高谷物日粮饲喂模式。2.基于蛋白组学技术研究绵羊瘤胃上皮对高谷物日粮的功能适应性机制本章利用液质联用（LC-MS/MS）无标记法蛋白组学,探究绵羊瘤胃上皮对高谷物日粮的功能适应性机理。试验设计同第二篇第一章,试验结束后采集绵羊瘤胃上皮组织进行蛋白组学鉴定及分析。结果发现,按FDR<0.05和VIP值>1.5的筛选条件,共筛选出146个差异显著蛋白。根据这些差异蛋白的表达趋势,将其分为3类,在此基础上,根据生物进程和KEGG通路分析结果,再挑选出56个差异性表达蛋白,这些蛋白主要富集于四个功能区:细胞生长调节;细胞肌动蛋白骨架调节;紧密连接调节以及代谢调节。运用RT-PCR技术,对其中的29个差异性蛋白的基因进行了验证。结果发现,功能区一中 PTGIS、CRYAB、ITGA5、ITGB1、FLNA、PPP1R12A、ILK、VCP和STAT3蛋白对应的基因表达趋势与蛋白表达趋势一致,这些蛋白主要功能涉及调控细胞周期、阻抑细胞凋亡和促进细胞增殖过程;功能区二和功能区三中ARPC4、APRC5L、PFN2、ACTN1、ACTN4蛋白对应的基因表达与蛋白表达相一致,这五个蛋白主要与屏障功能及细胞紧密连接相关;功能区四OXCT1、UGT1A1、PFKM、DDOST、P4HB蛋白对应的基因表达与蛋白表达一致。结果表明,随着饲喂高谷物日粮时间的延长,绵羊瘤胃上皮发生功能性变化,主要过程涉及到细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期调控、细胞肌动蛋白骨架调节、细胞紧密连接调节和代谢调节。3.持续饲喂高谷物日粮对绵羊瘤胃上皮细胞增殖与细胞凋亡的影响本章旨在探究持续饲喂高谷物日粮对绵羊瘤胃上皮细胞增殖与细胞凋亡影响的研究。试验同第二篇第一章。试验结束后采集瘤胃上皮,通过流式细胞术研究瘤胃上皮细胞增殖和细胞凋亡的情况。结果发现,随着高谷物日粮饲喂时间的增加,绵羊瘤胃上皮细胞G0/G1期细胞比例呈线性下调（P<0.001）,处于S期的瘤胃上皮细胞比例呈线性上调（P=0.006）,绵羊瘤胃上皮细胞G2/M期细胞比例呈三次方上调（P=0.004）。采用Real-time PCR定量与瘤胃上皮细胞周期相关基因mRNA相对表达量的结果显示,随着饲喂高谷物日粮的时间增加,CyclinE1的mRNA表达量呈线性下调（P=0.021）,CDK-2的mRNA表达量呈线性下调（P=0.001）,同时,CyclinEl蛋白表达量与基因表达的变化趋势一致。随着高谷物日粮饲喂时间增加,瘤胃上皮细胞凋亡比例呈二次方下降（P<0.001）。对绵羊瘤胃上皮细胞凋亡相关基因定量发现,随着高谷物日粮饲喂时间增加,Caspase8基因相对表达量呈二次方下调（P=0.012）,瘤胃上皮Bad基因相对表达量呈趋势下降（P=0.053）。结果说明,持续性饲喂高谷物日粮可影响瘤胃上皮细胞周期蛋白CyclinE1和细胞周期蛋白激酶CDK2的表达,加快瘤胃上皮细胞周期进程,减弱瘤胃上皮细胞凋亡,进而导致瘤胃上皮乳头发生适应性变化。4.持续饲喂高谷物日粮对绵羊瘤胃上皮IGF-1信号通路的影响本章主要研究高谷物日粮影响绵羊瘤胃上皮细胞增殖与凋亡的分子机制。动物试验设计同第二篇第一章。试验过程中采集血液,用于检测IGF-1浓度,试验结束后采集瘤胃上皮组织,用于IGF-1通路中相关基因及蛋白的检测。结果发现,随着饲喂高谷物日粮时间的增加,绵羊血浆中IGF-1浓度呈线性增高（P=0.002）,绵羊瘤胃上皮细胞IGF-1信号通路中相关基因的表达量发生变化,瘤胃上皮IGF-1基因相对表达量呈二次方上调（P<0.001）,IGF-1R的mRNA表达量呈线性上调（P<0.001）。IRS-1基因表达量呈三次方变化（P=0.029）,Raf1 mRNA的表达量呈线性上调（P<0.001）。同时,随着饲喂高谷物日粮时间的延长,瘤胃上皮MAPK基因、IGFBP2和IGFBP5基因（P<0.01）相对表达量呈线性上调,而IGFBP3的相对表达量呈线性下调（P=0.002）。对IGF-1信号通路上的重要蛋白的定量结果发现,持续性饲喂高谷物日粮对绵羊瘤胃上皮p-ERK和p-AKT蛋白表达无显著影响（P>0.001）,但线性上调了瘤胃上皮p-p38的蛋白表达（P=0.003）。相关性分析发现,瘤胃内丁酸和血液中的IGF-1含量与瘤胃上皮细胞增殖和细胞凋亡相关蛋白或基因呈显著相关。结果说明,高谷物日粮可通过提高瘤胃丁酸含量和血液中IGF-1浓度,从而激活瘤胃上皮细胞IGF-1信号通路,进而影响瘤胃上皮细胞增殖和凋亡,进而促使瘤胃上皮生长。5.体外研究IGF-1和丁酸钠促进绵羊瘤胃上皮细胞生长的机理本章旨在探究IGF-1和丁酸对瘤胃上皮细胞生长的作用及作用机制。试验选择体况良好的6月龄公湖羊,屠宰后采集瘤胃后腹盲囊组织,消化分离瘤胃上皮细胞,培养瘤胃上皮细胞至贴壁,利用不同浓度的IGF-1或丁酸钠处理瘤胃上皮细胞,根据不同处理试验分为三部分:5.1.不同水平的IGF-1对瘤胃上皮细胞周期及凋亡的影响本部分旨在研究不同水平的IGF-1对瘤胃上皮细胞周期及凋亡的影响。试验分别用浓度为0、25、50和75 μg/L的IGF-1处理瘤胃上皮细胞,细胞培养24 h后,收集细胞,采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况,采用Real-time PCR检测细胞周期和凋亡相关基因表达的变化。结果发现,随着IGF-1浓度的增加,绵羊瘤胃上皮细胞GoGi期细胞比例呈二次方变化（P=0.012）。而S期细胞比例则随着IGF-1浓度增加呈线性下降（P<0.001）。随着IGF-1浓度增加,绵羊瘤胃上皮G2M期细胞的比例呈线性上调（P=0.003）。随着IGF-1浓度增加,瘤胃上皮细胞的凋亡细胞比例呈二次方变化（P=0.001）。随着IGF-1处理浓度的增加,Cyclin E1的基因表达量呈线性下调（P=0.005）,CDK-2、Caspase3、Caspose8和Bad的基因表达量呈二次方变化（P<0.001）。CDK-4和CDK-6的基因表达量随着IGF-1浓度增加呈三次方变化（P<0.001）。结果说明,IGF-1可通过缩短瘤胃上皮细胞周期的S期来推进瘤胃上皮细胞细胞周期进程,并随着IGF-1浓度增高而加强瘤胃上皮细胞的凋亡。5.2.不同水平的丁酸钠对瘤胃上皮细胞周期及凋亡的影响本部分旨在研究丁酸钠对瘤胃上皮细胞周期及凋亡的影响。试验分别用浓度为0、2、4、6和8 mmol/L 丁酸钠处理瘤胃上皮细胞,细胞培养24 h后,收集细胞,采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况,采用Real-time PCR检测细胞周期和凋亡相关基因表达的变化。结果发现,随着丁酸钠处理浓度的增加,瘤胃上皮细胞处于G0G1期的细胞比例呈线性上调（P=0.006）,而处于S期的瘤胃上皮细胞比例呈线性下调（P=0.001）,处于G2M期瘤胃上皮细胞的比例呈二次方变化（P=0.012）。随着丁酸钠浓度的增高,瘤胃上皮细胞凋亡比例呈二次方变化（P<0.001）,2 mM、4mM和6 mM 丁酸钠组细胞的凋亡比例均显著低于0 mM和8 mM 丁酸钠处理组。随着丁酸钠处理浓度增高,绵羊瘤胃上皮细胞CyclinD1和CycliA2基因表达量呈二次方变化（P<0.001）。绵羊瘤胃上皮细胞CyclinE1（P<0.001）、CDK-2（P<0.001）、CDK-4（P=0.004）和CDK-6（P<0.001）基因表达量随丁酸钠处理浓度增高呈线性降低。随着丁酸钠浓度增高,瘤胃上皮细胞Caspase3基因的表达量呈二次方变化（P<0.001）。绵羊瘤胃上皮细胞Caspase8和Bad基因表达量随丁酸钠处理浓度增高呈三次方变化（P<0.001）。结果说明,丁酸钠可通过缩短S期,推进瘤胃上皮细胞细胞周期进程。其中,低浓度丁酸钠对瘤胃上皮细胞具有抑制凋亡的作用,而高浓度丁酸钠对瘤胃上皮细胞无抑制凋亡作用。5.3.IGF-1和丁酸钠联合处理对瘤胃上皮细胞增殖及凋亡基因的影响与机制研究本部分旨在研究IGF-1和丁酸钠联合处理对瘤胃上皮细胞增殖及凋亡基因的影响与机制。试验分别用 DMEM（0μg/L IGF-1+0 mM 丁酸钠）、25 μg/L IGF-1+2 mM 丁酸钠、50 μg/L IGF-1+4 mM 丁 酸钠、75 μg/L IGF-1+6 mM 丁 酸钠和 100 μg/L IGF-1+8 mM丁酸钠处理瘤胃上皮细胞,培养24 h后收集细胞,对细胞周期和凋亡相关基因进行定量。结果发现,随着IGF-1和丁酸钠联合处理浓度的增加,绵羊瘤胃上皮细胞CyclinD1（P=0.003）、CyclinA2（P= 0.011）和CyclinE1（P=0.033）基因表达量呈二次方变化。随着IGF-1和丁酸钠联合处理浓度的增加,瘤胃上皮细胞CDK-2（P=0.003）的基因表达水平呈线性上调,而绵羊瘤胃上皮细胞CDK-6（P=0.001）的基因表达水平呈三次方变化,Caspase3（P=0.002）和Bcl2（P=0.022）基因表达量呈二次方变化。同时发现,50 μg/LIGF-1和4mM 丁酸钠联合处理瘤胃上皮细胞产生的作用显著。在此基础上,进一步探讨了 50 μg/L IGF-1和4 mM 丁酸钠联合处理对瘤胃上皮细胞增殖的影响。试验用50 μg/L IGF-1和4 mM 丁酸钠的复合物处理细胞,细胞共分为五组,分别为阴性对照组（添加DMEM）、阳性对照组（添加50μg/L IGF-1和4 mM 丁酸钠）、ERK抑制剂组（添加50μg/L IGF-1、4 mM 丁酸钠和ERK抑制剂）、AKT抑制剂组（添加50 μg/LIGF-1、4 mM 丁酸钠和AKT抑制剂）、p38抑制剂组（添加50 μg/L IGF-1、4 mM 丁酸钠和p38抑制剂）和ERK抑制剂AKT抑制剂p38抑制剂组（添加50μg/L IGF-1、4 mM 丁酸钠、ERK抑制剂、AKT抑制剂和p38抑制剂）。处理细胞后24 h,开始收集细胞,同时对细胞增殖信号通路上关键蛋白进行免疫印迹定量检测。结果发现,50 μg/L IGF-1和4 mM 丁酸钠可促使瘤胃上皮细胞pERK、pAKT和pP38蛋白表达上调,而ERK抑制剂、AKT抑制剂和p38抑制剂会影响瘤胃上皮对应磷酸化蛋白的上调作用。结果说明,IGF-1和丁酸共存可影响Ras/Raf/MEK/ERK信号通路、PI3K/AKT信号通路和p38 MAPK信号通路中相关基因和蛋白的表达,进而影响瘤胃上皮细胞增殖和凋亡的生物学过程。综上,持续饲喂高谷物日粮导致绵羊瘤胃内丁酸浓度和血液中IGF-1含量增高,二者可能通过Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/AKT和p38/MAPK信号通路,调控瘤胃上皮细胞周期、细胞凋亡以及细胞增殖等相关蛋白的表达,从而实现瘤胃上皮各个细胞层的变化,继而增大瘤胃乳头吸收表面积,最终达到调控瘤胃内环境稳态的作用,促使绵羊瘤胃适应高谷物日粮的持续性饲喂。