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本次研究利用生物信息学方法,对华支睾吸虫eDNA文库的EST序列进行大规模同源性分析和Unigene拼接,筛选出RPEF(RNA polymeraseⅡ elongation factor)、TC(Transcriptional coactivator)、GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)三个基因作为本次研究对象,其研究内容主要包括:对华支睾吸虫cDNA文库所有ESTs 5端测序结果和3端测序结果,通过Wu-Blast程序进行Unigene归并,同时使用phrap软件对克隆进行序列拼接.使用NCBI上的Blastx程序寻找同源蛋白,预测编码蛋白的生物学功能.使用PCGENE软件、Antheprot-5软件和ExPASy程序分析编码蛋白的二级结构特征及搜寻功能性位点(Site)、功能性结构域(Domain),Swiss-model进行蛋白三维模建.采用PCR方法从成虫cDNA文库中扩增出RPEF基因、TC基因并测序鉴定.将CsRPEF基因、CsTC基因分别克隆入原核表达载体pGEX-4T-1和PET-30a(+),经PCR、酶切和测序鉴定重组子是否正确.将重组子pGEX-4T-1-RPEF、pGEX-4T-1-GAPDH(前期工作)和PET-TC在大肠杆菌BL21系统中经IPTG诱导进行大规模表达.对表达产物进行SDS-PAGE分析,检测重组蛋白分子量是否与预测值一致.使用GST的单抗和抗华支睾吸虫免疫兔血清进行Western blot免疫识别,鉴定重组蛋白pGEX-4T-1-RPEF和PET-TC是否正确表达和具有免疫学活性.分别使用Novagen公司的GST·Bindkit和His·Bindpurification kit按照操作说明亲和纯化重组蛋白pGEX-4T-1-RPEF、pGEX-4T-1-GAPDH和PET-TC,并使用thrombin凝血酶对经GST亲和层析柱纯化的融合蛋白GST-RPEF、GST-GAPDH进行酶切,Wash buffer再次过柱洗脱.分别对纯化蛋白CsRPEF、CsGAPDH、PET-TC进行SDS-PAGE分析和凝胶扫描分析,鉴定重组蛋白纯化效果和含量.采用Bradford法对所获得的纯化蛋白CsRPEF、CsGAPDH、CsTC的浓度分别进行测定.上述实验结果表明此次实验所获得的纯化蛋白可以很好的用于后续的基因生物学功能和结构的实验室鉴定.将纯化的目的蛋白CsRPEF、CsTC、CsGAPDH分别免疫BALB/C小鼠,40天后制备其免疫蛋白抗血清.采用间接ELISA法检测抗血清IgG抗体滴度及抗体产生的情况,同时采用Western blot免疫识别来鉴定制备的抗血清抗三种目的蛋白的特异性.采用S-P浓缩型免疫组化三步法对CsRPEF、CsTC、CsGAPDH三基因在华支睾吸虫成虫中的组织分布进行定位,同时采用荧光免疫定位法对Cs GAPDH基因在华支睾吸虫成虫和免疫小鼠中的分布和表达情况进一步加以确证.采用GAPDH的通用底物3-GAP(三磷酸甘油醛)反应体系来鉴定纯化蛋白CsGAPDH的酶催化活性.选择不同3-GAP浓度,测定GAPDH与催化底物转化量之间关系.选择不同的竞争性抑制剂AMP的浓度作用于酶反应体系,测定AMP对催化底物转化量NADH的影响,依据5分钟之内不同时间点的光密度值(ABS),计算重组蛋白CsGAPDH酶活力单位.本文通过生物信息学方法从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出了RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RNA polymerase Ⅱ elongation factor)、转录激活因子(transcriptional coactivator)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因,成功将三个基因予以克隆,表达,酶切、纯化,动物免疫实验获取了三个重组蛋白的抗血清,免疫组织化学法对三个基因在华支睾吸虫成虫中的组织分布分别进行了定位,并完成了重组蛋白CsGAPDH酶催化活性的初步测定.上述研究结果可为更深入地分析这三个基因的生物学功能以及华支睾吸虫病理想药物靶标和理想候选抗原的筛选奠定基础.