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目的:随着FDA批准抗CTLA-4和PD-1抗体在恶性晚期实体瘤中的应用。免疫治疗成为继手术、化疗、放疗后一种有效且副作用较小的疗法而被广泛应用于临床。通过调动人体自身免疫系统对抗肿瘤而非针对肿瘤本身,给新药研发的思维带来革命性的变化。抗PD-1单抗与现有治疗药物的联合,是目前具有潜力的研发方向。几乎所有的肿瘤药物,对免疫系统多或少有作用,这对他们的疗效和安全性产生重要影响。地西他滨(decitabine DAC)对免疫系统有无影响,研究较少。骨髓增生异常综合征(myelodysplastic sydrome MDS)和急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia AML)都是造血系统的恶性肿瘤。DNA甲基化(DNA methylation)导致的抑癌基因的失活是肿瘤发生的重要机理。DNA高甲基化在恶性血液病中广泛存在,多数研究发现甲基化修饰可以用药物逆转,使提高耐药及缓解复发率成为可能。DAC作为甲基化转移酶抑制剂,现已被FAB推荐用于MDS、老年AML、CMML的治疗中,但仍存在耐药、复发现象。近期,PD-1/PD-L1信号系统在血液系统恶性肿瘤中的作用屡见报道,PD-1抗体应用于血液系统肿瘤也取得了令人鼓舞的效果。因此研究DAC对PD-1/PD-L1的影响,联合两者共同应用,有望成为血液系统恶性肿瘤治疗的新方案。本实验研究DAC治疗MDS及AML患者前后PD-1/PD-L1的变化及其在SKM-1、HL-60细胞株中PD-L1的变化,为探索新的治疗方法打下基础。方法:1本研究收集了2016年1月至2017年1月河北医科大学第二医院血液内科根据WHO 2008分型初治MDS中符合WPSS预后分层中危组及高危组并接受DAC治疗的病人18例和初治AML并接受DAC治疗的病人20例(其中MDS中危组5例,高危组13例)以及非恶性血液病患者5例设为对照。MDS患者接受了DAC 20mg/m2 5天的方案;AML患者接受了DAC 20mg/m2 3天+CAG(Acla 20mg d4-6、Ara-c 10-20mg/m2 d4-10、G-CSF 300ug皮下注射d4-10)的化疗方案。均收集DAC应用前和DAC应用5天、3天后外周血和骨髓细胞(AML患者收集DAC+CAG第10天的骨髓细胞)。通过流式细胞技术以Per-CP CD45和SSA设门确定淋巴细胞及原始细胞分群,检测DAC治疗前后外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1和骨髓原始细胞上PD-L1的变化、通过实时荧光定量RT-PCR技术检测DAC治疗前后外周血单个核细胞及骨髓单个核细胞PD-1m RNA、PD-L1m RNA相对表达量的变化;2体外培养SKM-1、HL-60细胞株,应用CCK-8法探索适宜的DAC浓度,应用流式细胞技术检测DAC处理前后PD-L1的变化、实时荧光定量RT-PCR技术检测DAC处理后PD-L1m RNA相对表达量的变化。结果:1 FCM检测DAC治疗前MDS中、高危组和AML患者外周血T淋巴细胞上PD-1和骨髓单个核细胞上PD-L1的变化:(Table 1,Fig 1)MDS中、高危组及AML组患者DAC治疗前外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1的表达高于正常对照组,骨髓单个核细胞上PD-L1的表达与正常对照组无差别。2 FCM检测DAC治疗后MDS中、高危组和AML患者外周血T淋巴细胞上PD-1和骨髓单个核细胞上PD-L1的变化:(Table 2,Fig 1)MDS中、高危组及AML组患者DAC治疗后外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1的表达、骨髓单个核细胞上PD-L1的表达高于正常对照组及治疗前。3 FCM检测MDS/AML缓解组和未缓解组患者PD-1/PD-L1表达:(Table 3,Fig 2)MDS缓解组/未缓解组:未缓解组外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1的表达、骨髓单个核细胞上PD-L1的表达明显高于缓解组,差别有统计学意义(P=0.001)。AML缓解组/未缓解组:未缓解组外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1的表达、骨髓单个核细胞上PD-L1的表达明显高于缓解组,差别有统计学意义(P=0.001)。由此表明,PD-1/PD-L1高表达可能与DAC耐药有关,是预后不良的指标。4 PT-PCR检测DAC治疗前MDS中、高危组和AML患者外周血单个核细胞上PD-1m RNA和骨髓单个核细胞上PD-L1m RNA相对表达量变化:(Table 4,Fig3-4)MDS中、高危组及AML组患者DAC治疗前外周血单个细胞上PD-1m RNA的相对表达量高于正常对照组,骨髓单个核细胞上PD-L1m RNA的相对表达量与正常对照组无差别。5 PT-PCR检测DAC治疗后MDS中、高危组和AML患者外周血单个核细胞上PD-1m RNA和骨髓单个核细胞上PD-L1m RNA相对表达量变化:(Table 5,Fig3-4)MDS中、高危组及AML组患者DAC治疗后外周血单个细胞上PD-1m RNA的相对表达量、骨髓单个核细胞上PD-L1m RNA的相对表达量明显高于正常对照组及治疗前。6 RT-PCR检测MDS/AML患者缓解组和未缓解组PD-1/PD-L1表达:(Table 6,Fig5)MDS缓解组/未缓解组:未缓解组外周血单个核细胞上PD-1m RNA相对表达量、骨髓单个核细胞上PD-L1m RNA相对表达量明显高于缓解组,差别有统计学意义(P=0.001)。AML缓解组/未缓解组:未缓解组外周血单个核细胞上PD-1m RNA相对表达量、骨髓单个核细胞上PD-L1m RNA相对表达量明显高于缓解组,差别有统计学意义(P=0.001)。由此同样表明,PD-1/PD-L1高表达可能与DAC耐药有关,是预后不良的指标。7 DAC对SKM-1、HL-60细胞的增殖抑制作用应用CCK-8法检测DAC对SKM-1、HL-60细胞增殖的影响,以0、0.5、5、50、500umol/l浓度梯度的DAC干预SKM-1、HL-60细胞24h、48h、72h后,结果显示DAC对SKM-1、HL-60细胞表现出明显的抑制作用,且具有时效及剂量依赖特点;SKM-1、HL-60 48h IC50接近50umol/l、72h IC50接近0.5umol/l。分别以0、0.5、50、500umol/l浓度梯度的DAC进行FCM及RT-PCR检测。8 FCM检测不同时间和浓度DAC处理SKM-1、HL-60后PD-L1的变化:(Table 7,Fig6-7)MDS/白血病SKM-1、HL-60细胞株PD-L1的平均表达值随DAC浓度(0、0.5、50、500umol/l)及时间(24h、48h、72h)的变化而增加,DAC浓度50umol/l时表达最高。9 RT-PCR检测不同时间和浓度DAC处理SKM-1、HL-60后PD-L1m RNA相对表达量的变化:(Table 8-9,Fig8-9)MDS/白血病SKM-1、HL-60细胞株PD-L1m RNA相对表达量随DAC浓度(0、0.5、50、500umol/l)及时间(24h、48h)的变化而增加,DAC浓度50umol/l时,PD-L1m RNA相对表达量最高。结论:1正常人外周血T淋巴细胞和骨髓单个核细胞上存在PD-1/PD-L1的表达。2 MDS中危组患者骨髓单个核细胞上PD-L1的表达与正常对照组无差别,外周血T淋巴细胞上PD-1的表达高于正常对照组;经DAC治疗后PD-1/PD-L1表达明显升高。3 MDS高危组患者骨髓单个核细胞上PD-L1的表达与正常对照组无差别,外周血T淋巴细胞上PD-1的表达高于正常对照组;经DAC治疗后PD-1/PD-L1表达明显高于正常对照组及MDS中危组。4 AML患者接受DAC治疗前骨髓单个核细胞上PD-L1的表达与正常对照组无差别,外周血T淋巴细胞上PD-1的表达高于正常对照组,接受DAC治疗后PD-1/PD-L1的表达都明显升高。5 PD-1/PD-L1与预后:MDS、AML未缓解组FCM外周血T淋巴细胞上PD-1表达、骨髓单个核细胞上PD-L1表达和RT-PCR外周血PD-1m RNA相对表达量、骨髓单个核细胞上PD-L1m RNA相对表达量都明显高于缓解组,PD-1/PD-L1表达增高可能介导DAC耐药,可作为评价预后的指标之一。6 MDS/白血病细胞株SKM-1、HL-60细胞株上存在PD-L1表达,DAC治疗后PD-L1表达上升,以DAC浓度50umol/l表达最高。