多年来关于钙元素在蛋禽中营养作用的共识是:钙是维持产蛋家禽蛋壳和骨骼形成的必需矿物元素。然而更多的证据表明,饲粮中钙水平与产蛋数（表现为产蛋率）存在紧密联系,饲粮钙缺乏对产蛋率具有显著负面影响,且性成熟的蛋鸭排卵数对饲粮中钙水平有依赖效应（本课题组未发表的数据）。由于蛋禽产蛋数与成熟卵泡排卵数紧密相关,因此,饲粮中钙除参与蛋壳形成外,很可能也参与了卵母细胞发育成熟调控。但目前,关于钙元素在蛋鸭乃至家禽中的繁殖生物学作用研究报道甚少,其参与蛋禽卵泡成熟的调控功能和作用机制仍有待被进一步揭示。因此,本研究通过筛选不同等级卵泡和不同产蛋阶段鸭颗粒细胞中钙信号等关键信号蛋白,并研究钙离子信号调控对蛋鸭繁殖功能作用,最后体外研究钙对颗粒细胞功能影响的调控机制,本研究结果为蛋禽中钙的生物学功能提供新的理论基础。主要研究内容和结果如下:1.蛋鸭卵泡发育过程中颗粒细胞差异信号蛋白的筛选为了筛选蛋鸭卵泡发育过程中关键信号蛋白变化,本试验分离180日龄产蛋高峰期蛋鸭小白卵泡（1-3 mm）、大白卵泡（3-6 mm）、小黄卵泡（6-8 mm）、最小等级卵泡（F4）颗粒细胞,并开展DIA蛋白组学检测。蛋鸭卵泡发育过程中差异通路变化最显著的10个代谢或信号通路主要包括:代谢、次级代谢物合成通路、内吞、粘附、细胞骨架调节、MAPK信号通路、RNA转运,紧密连接及钙离子信号通路。GO富集分析发现,差异表达蛋白在生物学过程主要包括生物学粘附、繁殖、免疫过程;细胞组分主要分类为细胞连接、外细胞基质、细胞膜;分子功能主要包括抗氧化活力、转运活性、催化活性和信号分子转导活性等功能。差异蛋白趋势化分析发现,310个蛋白表达平稳而后在F4卵泡中显著下降,284个蛋白表达随卵泡发育而线性下降,223个蛋白表达随卵泡发育而线性上升,202个蛋白表达仅在F4卵泡中显著上升。钙离子信号相关蛋白分析发现,钙应激通道蛋白1、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶等6种蛋白表达随卵泡等级发育而上升。而钙结合蛋白、线粒体钙结合转运蛋白等12种蛋白表达则随卵泡发育而下降,AMH蛋白表达则随卵泡发育而下降。以上结果表明,颗粒细胞中钙离子、MAPK、AMH等信号在蛋鸭卵泡发育过程中变化较显著,可能对卵泡发育起到重要作用。2.产蛋后期蛋鸭与高峰期蛋鸭生长卵泡中钙离子信号等关键差异基因筛选为了从卵泡发育延缓模型（产蛋后期）筛选卵巢中钙相关信号变化,本试验采集180日龄产蛋高峰期和700日龄产蛋后期蛋鸭血浆和卵泡样本开展分析。相比产蛋高峰期,产蛋后期蛋鸭优势卵泡（直径＞8 mm）和1-3 mm卵泡数量显著下降（P＜0.05）,血浆和卵巢组织中钙水平显著降低（P＜0.05）。产蛋后期和高峰期蛋鸭1-3 mm卵泡颗粒细胞转录组GO分析表明,生物学过程通路差异基因主要包括细胞发育、细胞信号、粘附、繁殖等生物学过程;细胞组分主要为细胞膜、外细胞基质、细胞连接等;分子功能主要包括核酸结合、催化活性等。KEGG分析表明,卵泡细胞外基质、基底膜、胶原蛋白、细胞连接等信号通路是重要的差异通路。相比高峰期,产蛋后期蛋鸭1-3 mm卵泡颗粒细胞中参与钙转运的蛋白编码DEGs共8个发生了显著改变,其中6个DEGs发生显著上调,包括Ca2+-ATPase（ATP2B1,ATP2C2）、钙结合蛋白Calbindin（CALB1）,和2个蛋白编码（钙通道蛋白CACNG3,循环依赖激酶A2CDK5A2）,且产蛋后期卵巢中抗氧化酶基因Gpx1和Mn-SOD m RNA显著下调,而卵泡闭锁相关信号基因FAS、Caspase3、ATF6 m RNA显著上调。本研究表明产蛋后期鸭卵巢中抗氧化酶下调导致氧化应激现象,同时钙转运发生改变导致卵巢钙稳态变化,暗示钙离子信号和抗氧化能力变化可能是诱导产蛋后期卵泡闭锁加快的重要因素。3.钙通道激动剂辣椒素对蛋鸭卵泡发育及钙信号的影响为进一步探讨钙信号在蛋鸭卵泡发育中的作用,本试验通过饲粮中添加钙通道激动剂辣椒素（CAP）研究其对蛋鸭卵泡发育和卵巢钙通道激活的影响。选择58周龄健康龙岩山麻鸭378只,随机分为3组,每组6个重复,每重复21只鸭,单笼饲养。I组（对照组）饲粮为玉米-豆粕型饲粮;Ⅱ组饲粮为基础饲粮中添加150 mg/kg辣椒素,且采食量保持与对照组相同;Ⅲ组饲粮为基础饲粮中添加150 mg/kg辣椒素,自由采食;试验持续8周。结果表明:与对照组相比,两个添加辣椒素试验组蛋鸭血浆Gpx活性显著增加（P＜0.01）,卵巢中MDA含量显著降低（P＜0.01）,大黄卵泡相对重量显著增加（P=0.01）。试验Ⅲ组蛋鸭采食量较对照组显著提高（P＜0.001）,饲料转化率（FCR）表现出降低趋势（P＜0.1）。试验II组蛋鸭小黄卵泡相对重量显著高于其他两组（P＜0.01）;且卵巢CDK1、TRPV4、ATP2A2、ITPR1和Ca M m RNA表达显著高于其他两组（P＜0.05）,优势卵泡数量有高于对照组趋势（P=0.06）。以上结果表明,饲粮中补充CAP可通过激活钙信号通路和改善氧化还原状态,进而促进蛋鸭卵泡发育。4.钙对蛋鸭卵泡颗粒细胞功能调控的机制研究为了深入探讨钙介导卵泡发育成熟的细胞学机制,通过颗粒细胞体外培养实验,首先发现钙离子螯合剂EGTA和钙离子通道阻断剂verapamil随浓度上升线性降低（P＜0.01）两种等级前卵泡（3-6 mm、6-8 mm）颗粒细胞增殖率。钙通道激动剂A23187随浓度先提高3-6 mm卵泡颗粒细胞增殖率而后逐渐降低其增殖率。进一步研究发现,颗粒细胞中c AMP生成随A23187浓度线性上升,而随EGTA、Verapamil浓度而线性下降,且EGTA、Verapamil均能显著提高细胞中c AMP降解酶基因PDE1A m RNA表达（P＜0.01）,表明,颗粒细胞中钙可通过作用PDE1A影响c AMP生成。此外,EGTA能显著降低颗粒细胞紧密连接（P＜0.05）,且EGTA与Verapamil能显著降低细胞中紧密连接蛋白基因GJC1或GJA1 m RNA表达（P＜0.01）,而继续添加0.5和2.0μM dc AMP后能显著提高GJA1或GJC1 m RNA表达丰度（P＜0.05或P＜0.0001）。以上结果表明,钙可通过c AMP影响颗粒细胞间紧密链接和细胞间互作关系,进而影响卵泡发育。综上所述,产蛋高峰期蛋鸭卵泡发育过程中颗粒细胞钙离子信号发生显著改变,产蛋后期蛋鸭卵巢中钙水平下降并诱导卵泡闭锁信号激活,通过蛋鸭饲粮中添加钙离子通道激动剂辣椒素可促进卵巢中钙离子信号激活,并促进卵泡发育和改善产蛋性能,其机制可能与钙作用颗粒细胞中cAMP生成有关。