胃癌是全球死亡率位居第三的恶性肿瘤疾病。目前,对于胃癌的发生和发展分子机制尚不明晰。转录因子FOXS1是我们基于TCGA测序数据筛选到的新的胃癌组织与正常组织之间显著差异表达的基因之一,位于chr20q11.21。TCGA胃癌数据和GEO数据库分析结果均显示FOXS1基因在胃癌中显著高表达;并且通过RT-PCR和免疫组化检测发现FOXS1在胃癌中也显著高表达,这一系列结果提示FOXS1基因可能促进胃癌的发生发展。Fox转录因子家族因含有保守的叉头框的DNA结合结构域而被命名,其成员在肿瘤发生发展中具有非常重要的作用。Fox家族已成为肿瘤研究中的热点。然而,目前FOXS1作为Fox家族最新发现的一个成员,其在胃癌中的生物学功能与分子机制研究至今未被报道,因此本论文重点研究FOXS1转录因子与胃癌临床意义的关系以及其对细胞增殖、周期、侵袭与迁移等生物学功能的影响,并阐明其发挥生物学功能的分子机制。目的:探讨转录因子FOXS1在胃癌中的表达及临床价值。体外检测FOXS1基因对胃癌细胞生长、周期和克隆形成能力的影响。体内检测FOXS1基因对胃癌细胞裸鼠成瘤能力的影响。检测FOXS1基因对胃癌细胞侵袭与迁移能力以及EMT的影响。明确FOXS1基因的上游启动子区及上游调控机制。探讨分析FOXS1基因在胃癌中参与的信号通路。探讨分析FOXS1相关的miRNAs,并研究其调控机制。方法:从癌症基因组图谱(TCGA)数据库收集胃癌数据集,下载FOXS1基因表达谱资料及临床信息资料,分别采用SPSS统计分析胃癌组织和正常组织FOXS1的表达,总结其与临床病理参数和预后的关系;并利用Kaplan-Meier乘积极限法和Cox比例风险回归模型分析其对患者临床预后的影响。GEO数据库中GSE19826,GSE13911和GSE51575数据集作为验证集。在线分析工具GEPIA分析FOXS1基因在多种肿瘤中的表达水平。在多种胃癌细胞和胃正常上皮细胞GES-1中RT-PCR和WB分别检测FOXS1的表达。在临床收集的35对胃癌及癌旁组织中,RT-PCR、WB和IHC分别在mRNA和蛋白水平上进一步验证其表达。IHC检测胃癌组织芯片中FOXS1的表达。采用siRNA沉默FOXS1基因和慢病毒感染过表达FOXS1基因后,分别用CCK8,流式细胞术检测FOXS1基因对细胞生长和周期的影响。平板克隆实验检测FOXS1基因对细胞克隆形成能力的影响。裸鼠成瘤实验体内检测FOXS1基因过表达对胃癌细胞体内成瘤能力的影响。细胞划痕实验和Transwell实验检测FOXS1基因过表达或敲降后对胃癌细胞迁移与侵袭能力的影响,IF,WB,IHC检测FOXS1基因过表达或敲降后对胃癌细胞EMT标志物的表达影响。构建FOXS1基因启动子区不同长度的荧光素酶报告基因重组质粒,双荧光素酶报告基因实验分析FOXS1基因启动子区位置。生物信息学预测结合在FOXS1启动子区域的转录因子,利用双荧光素酶报告基因分析实验初步验证。Western Blot,RT-PCR进一步验证转录因子对FOXS1基因表达的调控。生物信息学预测转录因子与FOXS1启动子区域的结合序列,并对该序列进行定点突变,双荧光素酶报告基因分析以及ChIP实验验证其是否直接结合在该序列。根据TCGA数据库中患者的RNA-seq数据中FOXS1基因的表达水平将数据分为FOXS1高表达组和FOXS1低表达组,对两组基因进行基因富集分析(GSEA)方法并进行统计学分析。生物信息学方法预测在胃癌中与FOXS1表达相关的miRNA。RT-PCR、WB实验验证miRNAs对FOXS1基因表达的影响。在GP-miRGLO载体中萤火虫荧光素酶基因的下游分别插入FOXS1 3’-UTR中的野生型或突变体结合位点片段,构建载体,双荧光素酶基因报告分析检测miRNAs有无结合到FOXS13’UTR。结果:分析TCGA数据库首次发现,相对于胃正常组织,FOXS1的表达在胃癌组织中显著上调。FOXS1高表达与胃癌患者年龄、T分期显著相关。KM plotter结果显示高表达FOXS1与胃癌病人较差的预后显著相关。COX比例风险回归结果提示FOXS1高表达是胃癌患者不良预后的独立危险因素。GEPIA和GEO数据库分析均显示FOXS1基因在胃癌中特异性高表达。在5种胃癌细胞中,mRNA水平和蛋白水平FOXS1的表达均显著高于GES-1。RT-PCR证实了在临床收集的35对胃癌及癌旁组织中FOXS1在胃癌组织中高表达。临床收集的前8对组织中,Western Blot和免疫组化均显示FOXS1基因在蛋白水平在胃癌中也明显高表达。胃癌组织芯片(10例正常肝组织、15例早期胃癌组织,55例晚期胃癌组织)免疫组化结果显示,相对于正常胃组织,早期胃癌组织中FOXS1蛋白7例高表达,晚期胃癌组织中45例高表达,提示FOXS1可以更好的指示晚期胃癌。FOXS1基因敲降显著抑制了胃癌细胞生长,抑制了细胞周期G1/S期检测点途径的激活并且抑制了胃癌细胞的克隆形成能力;而FOXS1基因过表达产生了相反的作用,且在体内促进了胃癌细胞的体内成瘤能力。FOXS1基因过表达促进了胃癌细胞迁移与侵袭作用且降低了E-cad的表达,增加了N-cad的表达,而FOXS1敲降具有相反的作用。双荧光素酶报告基因实验结果显示FOXS1基因启动子区域位于-660bp~0bp。NFKB1主要结合在-1100bp~-660bp区域,11个潜在的SP1结合位点,4个潜在的STAT3结合位点和7个潜在的E2F1结合位点位于FOXS1启动子-380~+1的区域。双荧光素酶报告基因实验显示NFKB1显著抑制了FOXS1启动子-1100bp~-660bp区域的活性,而SP1,E2F1,STAT3显著促进了FOXS1启动子-380~+1区域的启动子活性。RT-PCR和WB实验证实,NFKB1过表达显著抑制了FOXS1基因的表达。FOXS1启动子区域NFKB1结合位点的突变后,NFKB1转录因子不再对FOXS1启动子区具有调控作用。ChIP实验证明NFKB1不能直接结合在FOXS1启动子区域,这些结果提示NFKB1可能通过其它方式间接结合在FOXS1启动子区从而转录抑制其表达。GSEA数据分析得出FOXS1基因最显著富集在Hh信号通路。相关性分析显示,在胃癌中GLI1和FOXS1基因具有极高的相关性。GLI1过表达在mRNA和蛋白水平上显著抑制了FOXS1基因的表达,而GLI1敲降具有相反的作用。除此之外,在线软件预测分析,FOXS1基因启动子-660bp~+1bp区域有转录因子GLI1的结合位点。双荧光素酶报告基因分析显示GLI1过表达显著抑制了FOXS1基因启动子的活性,而GLI1敲降具有相反的作用。GLI1结合位点重要碱基突变后,GLI1敲降后对FOXS1突变后启动子的活性调节产生逆转的效果。ChIP结果显示GLI1基因可以直接结合到FOXS1基因的启动子区域。生物信息学方法初步筛选出两种miRNA(miR-328-3p和miR-125a-5p)。RT-PCR结果显示两种miRNAs在mRNA水平上都没有影响FOXS1的表达。Western Blot结果显示两种miRNAs分别过表达只有miR-125a-5p过表达显著抑制了FOXS1蛋白的表达水平,且miR-125a-5p抑制剂的使用具有相反的结果。双荧光素酶报告分析实验显示FOXS1 3`-UTR的miR-125a-5p结合位点突变后,miR-125a-5p抑制后对FOXS1 3`-UTR区的荧光素酶活性不再具有上调作用。结论:FOXS1可以作为胃癌的预后指标之一且和胃癌恶性表型相关,并且对晚期胃癌具有很好的指示作用。GLI1可直接结合在FOXS1启动子区进而转录抑制FOXS1基因的高表达,而miR-125a-5p可直接结合在FOXS1 3`-UTR区而抑制FOXS1蛋白的翻译,而这为针对FOXS1为靶点的治疗胃癌的方法提供了新思路。