论文部分内容阅读
肝硬化是常见的肝脏病理过程,常继发于肝脏炎症或脂肪肝等疾病,属于中医的胁痛、黄疸、臌胀等疾病的范畴。现有临床研究提示,中医药治疗具有特殊的疗效。中药枸杞具有滋补肝肾的效果,在临床中也被应用于部分证型的肝硬化治疗。且枸杞的主要成分之一甜菜碱含有甲基,参与部分基因DNA序列的甲基化（methylation）调控。在肝纤维化疾病发展过程中,表观遗传调控起着较为重要的作用。一般认为DNA序列甲基化可能导致染色体浓缩,抑制基因表达。由此,我们展开了对枸杞抗肝纤维化疗效的meta分析,同时研究了肝硬化中的DNA甲基化水平变化情况,并探讨了甜菜碱是否通过抑制相关基因DNA甲基化的方式改善肝纤维化。第一部分含枸杞的复方治疗肝硬化的meta分析目的:探讨含枸杞的中药复方在肝硬化治疗中的使用情况,分析其疗效,以期为临床使用枸杞提供有意义的依据。方法:首先,在 SinoMed、Pubmed、Embase、Cochrane 等数据库以枸杞（Lycium barbarum）,肝硬化（cirrhosis）,肝纤维化（liverfibrosis）为关键词进行检索。然后,对检索得到的文献进行筛选,提取文献基础资料及效应量,包括症状总体改善情况、肝酶谱、总胆红素及肝纤维化指标（透明质酸、层高粘连蛋白和Ⅲ型前胶原）。对纳入文献以Reviews Manager 5.3进行质量评价后,继续对枸杞的总体治疗效果、肝功能、肝纤维化指标分别进行分析。其中,二分类效应量以风险率进行分析,连续型变量以标准差进行分析。以I2判断纳入研究的异质性,p＜0.05被认为具有统计学意义。结果:经过筛选,共纳入10篇文献。分别进行对应分析后,相比常规治疗,加用含枸杞的中药复方治疗肝硬化,肝硬化得到了明显改善（p＜0.00001,RR=1.27,95%CI[1.16,1.38],I2=0%）,同时,谷丙转氨酶（p=0.02,SMD=-0.68,95%CI[-1.24,-0.13],I2=83%）、总胆红素（p＜0.0001,SMD=-0.81,95%CI[-1.20,-0.42],I2=93%）也明显降低。透明质酸（p=0.0004,SMD=-0.93,95%CI[-1.44,-0.42],I2=23%）、层粘连蛋白（p=0.0004,SMD=-0.90,95%CI[-1.40,-0.40],I2=0%）、Ⅲ型前胶原（p=0.005,SMD=-1.27,95%CI[-2.15,-0.39],I2=57%）得到明显改善。结论:含有枸杞的中药复方能明显改善肝硬化症状,在治疗肝硬化的时,可适当添加枸杞。第二部分 肝纤维化的DNA甲基化及基因表达目的:识别肝纤维化发生发展中的差异表达基因及差异甲基化基因,探讨基因甲基化与基因表达间的关系,并找出肝纤维化中甲基化改变的的重要基因和通路。方法:使用R语言及相关R包,在三个数据集中筛选肝硬化中的差异表达基因（DEGs）和差异甲基化基因（DMGs）,并绘制相关图表。使用clusterProfiler包和在线工具对DMGs进行通路富集分析。结果:共鉴定出357个DEGs和8830个DMGs。交叉分析后发现,411个基因表达趋势与甲基化呈正相关,而235个基因表达趋势与甲基化呈负相关,其余DMGs基因表达无改变。DMGs的通路富集分析得到若干甲基化改变的重要通路,如 PI3K-Akt,MAPK,cGMP-PKG,JAK-STAT,TGF-beta,NF-κB,PPAR 等。结论:基因甲基化并不一定抑制基因表达,也可能促进基因表达。同时为后续实验筛选出了 NF-κB通路作为重点关注对象。第三部分甜菜碱抑制肝纤维化的机制研究目的:研究甜菜碱缓解肝纤维化的作用及其机制。因此,我们研究了甜菜碱在细胞内抑制肝星状细胞分化及体内对纤维化的抑制作用。方法:本部分从细胞及大鼠两个层次对甜菜碱进行了研究。首先采用CCK-8测定和分子分析方法,研究甜菜碱对HSC-T6细胞的成纤维能力的影响。其次在利用四氯化碳造模的大鼠,对其肝纤维化进行多种染色观察,并以免疫印迹等方法检测了其NF-κB和DNMT3A的表达情况。最后,以NGS测序法用于确定RelA第二个甲基化岛的甲基化状态。结果:应用高剂量甜菜碱不会抑制细胞活化。HSC-T6细胞中α-SMA、colIVα1和纤维连接蛋白的表达被逆转。此外,大鼠肝脏纤维化明显减少。甜菜碱对HSC-T6细胞和大鼠肝脏中p65和p50的下调表明甜菜碱中的NF-κB信号传导可减轻纤维化。HSC-T6细胞和大鼠肝脏中三种DNA甲基转移酶的表达同时降低。p65（RelA）水平的降低伴随着DNMT活性的降低,这表明两者之间可能存在相关性。NGS测序显示p65（RelA）的启动子区-180位胞嘧啶甲基化状态降低。结论:甜菜碱对HSC激活和纤维化的抑制作用在体内外均得到证实。甜菜碱可能通过抑制RelA启动子区-180位胞嘧啶的甲基化水平,调控p65蛋白表达,发挥改善肝纤维化的作用。