目的:应用超高效液相技术建立五子衍宗丸的质量表征方法;建立超高效液相-高分辨质谱分析方法,表征其化学成分及口服给药后的体内直接作用物质基础;利用代谢物组学方法,从代谢生物标记物角度评价去单侧睾丸所致的大鼠肾虚精亏模型及五子衍宗丸的补肾益精作用,从代谢通路层面阐明五子衍宗丸的补肾益精作用机制。方法:建立五子衍宗丸的UPLC-PDA指纹图谱,评价五子衍宗丸的质量;利用超高效液相与高分辨质谱结合的技术表征并鉴定五子衍宗丸的化学成分和大鼠口服五子衍宗丸的入血成分;应用代谢组学研究方法,建立肾虚精亏模型大鼠的血液和尿液代谢物组的UPLC-MS/MS测定方法,借助数据模式识别方法（PCA、OPLS-DA和VIP）分析鉴定肾虚精亏证的代谢差异物,采用代谢通路拓扑分析方法定位富集代谢差异物的代谢通路,结合临床方法评价肾虚精亏模型;长期给予五子衍宗丸后,追踪肾虚精亏证模型大鼠生物标记物和差异代谢通路对五子衍宗丸的应答,结合临床方法评价五子衍宗丸的治疗作用,阐明五子衍宗丸补肾益精的作用机制结果:1五子衍宗丸化学成分的质谱分析及质量表征建立了五子衍宗丸甲醇提取物的指纹图谱,确定了20个共有指纹峰,经“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”分析,不同批次的样品指纹图谱相似度良好,质量均一稳定,为后续研究奠定基础。建立了五子衍宗丸化学成分的UPLC-ESI-LTQ-Orbitrap-MS分析方法,首次对五子衍宗丸的化学成分进行了系统的质谱分析,基于色谱和质谱数据,和有关标准品验证,参考文献,初步表征鉴定了 106个成分,包括有机酸、黄酮类、苯丙素类、生物碱和萜类化合物。其中来源于黄酮类的有35个,苯丙素34个,有机酸17个,萜类11个,生物碱8个,和1个维生素B2。表明六大类天然产物贡献了全方的化学物质基础构建。2 口服五子衍宗丸后大鼠含药血清成分的质谱分析通过血清样品制备工艺考察,建立血清样品的最适制备方法。利用模式识别方法对体外所建立的UPLC-ESI-LTQ-Orbitrap-MS分析方法的有效性进行验证,结果表明该分析方法重现性和分辨性良好,可用于大鼠血清成分的研究。利用上述分析方法对空白和含药血清进行质谱轮廓表征和MetQuest分析,基于色谱和质谱数据,结合质谱裂解规律、数据库和文献对五子衍宗丸入血成分进行分析,初步表征鉴定了 43个入血成分,包括20个原型成分和23个代谢产物。原型成分包括没食子酸、绿原酸、奎宁酸、咖啡酸、金丝桃苷、槲皮素、昂天莲碱、阿托品、京尼平苷酸、五味子素、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子提取物、黄芪甲苷、异槲皮苷、异鼠李素、淡黄木樨草甙、芹菜素。代谢产物既有Ⅰ相生物代谢产物如Demethyl-schisandrol B,Hydroxyl-schisantherin A,Dihydroxyl-deoxyschizandrin,Hydroxyl-schizandrin B,Demethyl-schisanhenol;Ⅱ相反应转化的产物如Gallic acid-O-glucuronide,Chlorogenic acid-O-glucuronide,Caffeic acid-O-glucuronide,Methyl-caffeic acid,Methyl-hyperoside,Quercetin-O-glucuronide,Methyl-quercetin,Ferulic acid-O-glucuronide,Kaempferol-O-glucuronide,Kaempferol-O-sulfate,Methyl-kaempferol,Isoquercitrin-O-glucuronide,Isorhamnetin-O-sulfate,Iuteolin-O-glucuronide,Methyl-baicalein-O-glucuronide,Methyl-baicalein,Homoplantaginin-O-glucuronide;也有经历复杂Ⅰ相及Ⅱ相生物转化的代谢产物,如Hydroxyl-salicylic acid-O-glucuronide。本研究首次对五子衍宗丸的入血成分进行了系统的质谱分析,并鉴定了结构,确定了每一个入血成分的母药,为五子衍宗丸的深入研究提供了物质基础。3.肾虚精亏模型的建立与评价手术去大鼠单侧睾丸复制肾虚精亏模型,由临床生化指标检测结果可知,与假手术组相比,肾虚精亏大鼠生殖内分泌神经网络系统调节激素（FSH、T、LH）,生殖器官调节免疫指标（睾丸组织SOD、MDA）,生精能力指标（精子数量及活动率）的表达具有显著差别。考察了脏器指数的变化,发现模型组大鼠的睾丸、前列腺和精囊腺指数显著下降。从大鼠睾丸和肾上腺的病理形态学检查可知,大鼠去单侧睾丸可对性器官和腺体造成损害,干扰生殖内分泌系统,进而影响大鼠的生精能力。通过临床生化指标结合病理切片进行药效评价,证明肾虚精亏模型复制成功。通过对肾虚精亏模型大鼠尿液和血液样品的制备方法考察,色谱和质谱分析条件的优化,建立了可应用于血浆和尿液样品正负离子双扫描模式质谱代谢轮廓分析的UPLC-MS/MS分析方法。考察方法有效性,表明方法重复性好、精密度高,适用于快速的高通量检测,可用于肾虚精亏模型大鼠代谢组学研究。基于已建立的代谢组学分析方法,对肾虚精亏证大鼠与假手术大鼠的尿液和血液质谱轮廓图进行分析,结果表明代谢物组内聚集重复,组间分散明显无交叉,证明模型复制成功。分析并鉴定贡献组间离散的内源性代谢差异物,通过反复验证,初步确定尿液和血液生物标记物共43个,来源于尿液的潜在生物标记物35个包括8-异前列腺素、鞘氨醇、胱硫醚、硫酸雄酮、二甲基精氨酸、3-羟基癸二酸、琥珀酰腺苷、脯氨酰基苯丙氨酸、2,8-二羟基-β-D-葡糖苷酸、4-烯丙戊酸、辅酶Q1、甲基组氨酸、3-氧代癸酸、3a,6a,7b-三羟基-5b-胆管甲酸、3-去氢葡糖、二羟基扁桃酸、辛酰基葡萄糖苷酸、4-羟基环己基乙酸、α-酮酸辛酸、3-羟基癸酸、壬酸、乙酰半胱氨酸、酮戊二酸、变肾上腺素、吡哆胺、癸二酸、辛二酸、己二酸二甲酯、2-羟基辛酸、甲氧基去甲肾上腺素、4,6-二羟基喹啉、5’-甲硫腺苷、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇硫酸盐、N-乙酰基-7-氧-乙酰神经氨酸、吡哆醛;血液潜在生物标记物8个,包括胆酸、甘氨胆酸、3-羟基十二烷双酸、去甲肾上腺素、十六酰肉毒碱、睾酮、二十四碳六烯酸、亚油酸。经代谢通路分析确定的差异代谢物主要涉及15条代谢通路,包括甘氨酸、丝氨酸及苏氨酸代谢;维生素B6代谢;脂肪酸代谢;鞘脂类代谢;半胱氨酸和蛋氨酸代谢;酪氨酸代谢;D-谷氨酰胺和谷氨酸的代谢;色氨酸代谢;氨的代谢;戊糖、葡萄糖醛酸转换;柠檬酸循环;丁酸代谢;丙氨酸,天门冬氨酸和谷氨酸的代谢;甾体激素生物生物合成;原发性胆汁酸的生物合成。4.五子衍宗丸补肾益精作用研究长期给予肾虚精亏证大鼠五子衍宗丸、丙酸睾丸素和五子衍宗丸+丙酸睾丸素后,综合比较了各给药组的临床化学指标和病理形态学改变。结果表明各给药组在相应指标上所表现出来的治疗作用强度和作用方面不相同,其中五子衍宗丸组表现出最强的治疗作用,与阳性药对照无显著性差异,五子衍宗丸+丙酸睾丸素组没有表现出协同作用。五子衍宗丸可以使肾虚精亏大鼠的的睾丸、前列腺和精囊腺指数、血清FSH、血清T、血清LH、睾丸组织SOD和MDA、精子数量及活动率等指标回调;使大鼠模型睾丸组织生精小管的水肿减轻,生精细胞排列规范,间质细胞数目接近假手术组;使肾上腺皮质细胞结构清晰,髓质胞质颗粒接近假手术组,毛细管充血减轻。通过追踪肾虚精亏证生物标记物在各给药组中的表达变化,分析与之相关联的代谢通路变化的生物学意义,关联代谢通路变化与五子衍宗丸补肾益精作用的关系。以期从代谢生物标记物和代谢通路的层面整体性的评价五子衍宗丸的治疗作用,探讨其机制。结果发现在五子衍宗丸应答的肾虚精亏证相关代谢通路中,五子衍宗丸的长期给予对18个生物标记物有显著的回调,表现良好的治疗作用（包括二氢神经酰胺、鞘氨醇、胱硫醚、硫酸雄酮、3-去氢-L-古龙酸、α-酮戊二酸、变肾上腺素、吡哆胺、甲氧基去甲肾上腺素、4,6-二羟基喹啉、5’-甲硫腺苷、吡哆醛、胆酸、甘氨胆酸、十六酰肉毒碱和睾酮）,同时直接作用于15条相关的代谢通路（主要是氨基酸代谢、糖代谢、脂质代谢和维生素B6代谢通路）,使代谢表达向着改善肾功能和提升生精能力的方向进行。丙酸睾丸素回调6个生物标记物,可直接作用于7条代谢通路;五子衍宗丸+丙酸睾丸素回调7个生物标记物,可直接作用于8条代谢通路。各给药组回调的生物标记物和代谢通路不相同,其中五子衍宗丸组表现出最强的综合调节作用,五子衍宗丸+丙酸睾丸素组没有表现出协同作用。说明五子衍宗丸整体性的作用于多个关键代谢差异物修复代谢途径紊乱,从生物标记物和代谢通路的层面阐明五子衍宗丸补肾益精作用的机制。结论:本实验对五子衍宗丸进行了系统的研究,建立了五子衍宗丸的质量表征方法并获得了较好的质量;建立了五子衍宗丸体内外成分的UPLC-MS/MS分析方法,表征并鉴定了五子衍宗丸的化学成分和血中移成分,初步确定了五子衍宗丸补肾益精的主要药效物质基础。采用代谢组学技术评价了肾虚精亏证和五子衍宗丸的治疗作用,并阐明了其补肾作用机制,为五子衍宗丸的深度研究奠定基础,临床应用提供依据。