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膜联蛋白超家族由13个生物学上和结构上高度相似(40%-60%)的钙依赖的磷脂结合蛋白组成。膜联蛋白A1 (Annexin A1, ANXA1, lipocortinⅠ)是膜联蛋白超家族中第一个被发现的成员,参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动,包括胞吞/胞吐作用、细胞分化和增殖、抑制花生四烯酸合成等多种重要的细胞生命活动。近年来的研究表明Annexin A1表达失调与肿瘤密切相关,并可能与肿瘤的侵袭转移相关,但机制不清。本实验旨在构建pcDN A3.1-Annexin A1真核表达载体,以转染低表达Annexin A1基因的结直肠癌细胞株SW480,使之上调该基因的表达,探讨Annexin A1对结直肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响,为进一步研究Annexin A1在结直肠癌侵袭和转移等方面的角色增添基础。第一部分人Annexin A1基因真核表达载体的构建目的：克隆Annexin A1基因和构建Annexin A1真核表达质粒,为进一步的功能研究提供有利的工具。方法：提取正常人体胎盘组织总RNA, RT-PCR扩增人AnnexinA1基因编码区全长序列,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1真核表达载体上,构建pcDNA3.1-Annexin A1重组真核表达质粒,通过PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果：将Annexin A1基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1 (+),酶切、PCR和测序鉴定结果表明,插入的序列与GenBank上的人的Annexin A1基因mRNA序列完全相符。结论：成功构建重组质粒pcDNA3.1-Annexin A1真核表达载体。第二部分pcDN A3.1-Annexin A1转染SW480细胞及其生物学效应目的：建立并鉴定稳定转染pcDNA3.1-Annexin A1的结直肠癌细胞株SW480,研究Annexin A1基因对结直肠癌细胞株SW480细胞迁移和侵袭能力的影响。方法：将Annexin A1基因的真核表达质粒pcDNA3.1-Annexin A1和空载体pcDNA3.1质粒应用脂质体介导的方法分别转染体外培养的结直肠癌细胞SW480,G418筛选稳定表达株,实时荧光定量PCR和Western blot方法检测Annexin A1基因的表达。以重组体pcDN A3.1-Annexin A1转染的SW480细胞为研究对象,以空载体转染组及未转染的SW480细胞作为对照,通过划痕修复实验、Transwell细胞侵袭实验对转染前后细胞的迁移和侵袭能力进行比较观察和分析。结果：pcDNA3.1-Annexin A1载体转染SW480细胞后,G418筛选获得稳定表达株；实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示,重组体pcDNA3.1-Annexin A1稳定转染细胞株中Annexin A1 mRNA水平和蛋白水平的表达明显高于空载体转染及未转染组细胞,而后两者间比较无统计学差异。对转染前后的细胞观察表明,重组体pcDNA3.1-Annexin A1转染组SW480细胞的迁移率(0.415±0.0022)明显高于空载体转染组(0.267±0.0025)及未转染组细胞(0.271±0.0021),差异具有统计学意义(P<0.05),而后两者间差异无统计学意义(P>0.05)；与空载体转染组(162.8±12.07)及未转染组(164.25±9.5)相比,重组体pcDNA3.1-Annexin A1转染组穿膜细胞数(221.75±12.07)显著增多,差异具有统计学意义(P<0.05).结论：成功构建稳定转染pcDNA3.1-Annexin A1的结直肠癌细胞系；Annexin A1基因表达上调能提高结直肠癌细胞迁移和侵袭能力。