【摘 要】
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目的:针对脓毒症治疗中清除致病菌和抑制炎症过度反应的临床需求,构建同时具备良好抗菌及抗炎特性的氧化铜/抗菌多肽/细胞膜（CuO-Tcp25-CM）纳米材料,并分别评价其生物相容性、体外抗菌性能、体外抗炎性能以及对小鼠脓毒症模型的干预效果进行全面评估。方法:1.利用氯化亚铜（Cucl）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和谷胱甘肽（GSH）合成氧化铜（CuO）,然后将抗菌多肽（Tcp-25）通过1-（3-二甲
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81972080）； 广东省科技计划项目（2017B030314139）；
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目的:针对脓毒症治疗中清除致病菌和抑制炎症过度反应的临床需求,构建同时具备良好抗菌及抗炎特性的氧化铜/抗菌多肽/细胞膜（CuO-Tcp25-CM）纳米材料,并分别评价其生物相容性、体外抗菌性能、体外抗炎性能以及对小鼠脓毒症模型的干预效果进行全面评估。方法:1.利用氯化亚铜（Cucl）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和谷胱甘肽（GSH）合成氧化铜（CuO）,然后将抗菌多肽（Tcp-25）通过1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）接枝到材料表面,并包被小鼠骨髓间充质干细胞的细胞膜,最终合成CuO-Tcp25-CM。使用高分辨率的透射电镜（TEM）、傅立叶变换红外吸收光谱仪（FTIR）、X射线衍射仪（XRD）、Zeta电位测量仪检等测试材料的理化特性。2.通过CCK-8法、细胞死活染色法、溶血实验评估材料的生物相容性。3.通过材料分别与金黄色葡萄球菌（S菌）、大肠杆菌（E菌）以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（M菌）共培养后涂板结果评估CuO-Tcp25-CM材料的抗菌性能。4.通过实时荧光定量PCR（qPCR）和酶联免疫吸附剂测定（ELISA）技术评估材料对炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-10和IL-1 β）影响,通过qPCR和蛋白免疫印迹（WB）技术评估材料对巨噬细胞极化的影响,通过ELISA和免疫荧光染色评估材料对E-Selectin表达的影响。5.通过构建脓毒症小鼠模型,评估材料的体内抗对脓毒症的干预效果。结果:1.本实验成功构建CuO-Tcp25-CM纳米颗粒。通过电镜扫描可见CuO呈梭形状态,FTIR显示材料的官能区位于3300-3600cm-1,表明存在羟基（-OH）,指纹区位于400-700 cm-1。XRD图谱提示样品的晶体特征峰与CuO的标准卡片特征峰位置基本重合。Zeta电位结果为-12mV,表明CuO-Tcp25-CM纳米材料倾向于凝结,抗菌肽及细胞膜成功包被在CuO表面。2.CuO-Tcp25-CM纳米颗粒,具有良好的生物相容性。细胞毒性与浓度呈现正相关,当浓度为10 μg/mL时,在共培养1天及7天对小鼠成纤维细胞无明显毒性。体外溶血实验发现,浓度在200 μg/mL时,材料无急性溶血反应。3.CuO-Tcp25-CM纳米颗粒体外具有良好的抗菌效能。抗菌效果与浓度呈现正相关。抗菌种类来说,对E菌抑制作用最强,S菌次之,M菌最差。当浓度为 10 μ g/mL 时,抑菌率分别为:S 菌:97.90±1.74%、E 菌:99.55±0.45%、M菌:90.75±2.99%,均具有较强抑菌效果。4.CuO-Tcp25-CM纳米颗粒体外具有良好的抗炎效能。10 μg/mL的材料能有效下调促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的表达,上调抑炎因子（IL-10）的表达。此外,材料还可以有效的抑制E-Selectin的表达,影响下游的炎症反应。可促进巨噬细胞从M1型极化向M2型极化,从而影响炎症反应状态。5.体内实验发现CuO-Tcp25-CM纳米材料能有效的提高脓毒症小鼠的生存率,对炎症反应有一定抑制作用,减少肝肾功能损伤。重要器官切片观察表明该材料无明显生物毒性,具有良好的体内生物安全性。结论:CuO-Tcp25-CM纳米颗粒具有良好的生物相容性,同时具备良好的体外抗菌及抗炎功能,在体内小鼠脓毒症模型中能显著提高小鼠生存率,减轻全身炎症反应。本研究为抗脓毒症生物材料的研究提供了新的思路,为临床脓毒症的治疗提供了新的策略。
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