非达霉素是（fidaxomicin）一种18元大环内酯类聚酮化合物,对革兰氏阳性致病菌具有明显的抑制作用。2011年6月,非达霉素被美国FDA批准上市用于治疗艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection,CDI）。目前,对于非达霉素的生物合成机制已有了较深入的研究,但对其生物合成中的调控机制还知之甚少;且非达霉素生产菌株Actinoplanes deccanensis YP-1在发酵过程中存在发酵水平低、产生副产物（橙红色素）以及遗传不稳定性等问题,极大地限制了非达霉素的生产和应用。本论文以A.deccanensis YP-1为研究材料,揭示了途径特异性调控因子FadR1对非达霉素生物合成的转录调控机制,初步解析了与A.deccanensis菌株遗传不稳定性相关的机制;同时,利用组合工程策略对菌株进行改造,构建了非达霉素高效合成生物体系,所获得菌株具有较好的遗传稳定性,为非达霉素工业化生产奠定了基础;另外,本文提出的组合工程策略也可广泛应用于其它工业放线菌的改造,有望推动微生物制药工业的发展。首先,我们通过生物信息学分析发现,非达霉素生物合成基因簇中存在一个潜在的LAL家族途径特异性调控基因fad R1。对fad R1基因进行敲除、回补、高表达等基因操作后发现,fad R1基因敲除株（Δfad R1）几乎丧失了合成非达霉素的能力,回补fad R1基因可基本恢复其生产能力;而fad R1基因高表达株（OE-R1/WT）中非达霉素的产量是野生型菌株的4.5倍。EMSA实验表明,FadR1调控因子能与fad M、fad A1-fad P2、fad S2-fad C和fad E-fad F的基因间隔区域发生特异性结合;结合转录单位分析结果可知,这四个基因间区域的启动子控制了非达霉素生物合成途径中大部分关键基因的转录。此外,DNase I footprinting实验显示,FadR1蛋白与上述四个区域的具体结合位点中都含有5′-CCCTNxAGGG-3′或者5′-AGGG-3′的序列,表明这些结合位点之间具有高度的保守性。上述结果证实了FadR1对非达霉素的生物合成具有正调控作用;同时,我们总结了FadR1对非达霉素生物合成的调控模式,即FadR1蛋白通过结合在fad M、fad A1-fad P2、fad S2-fad C和fad E-fad F的基因间隔区域,进而直接或间接地正调控非达霉素合成基因簇中近30个基因的表达,最终调控非达霉素的产量,为后续非达霉素工业高产菌株的构建奠定了理论基础。本研究分析了A.deccanensis YP-1基因组中与菌株遗传不稳定性相关的元件,并使用CRISPR/Cpf1介导的基因组编辑系统删除了8个遗传不稳定元件,包括6个最大的基因组岛（GIs）、一个内源性CRISPR/Cas系统以及一个非同源末端连接途径（NHEJ）,从而构建了一株遗传稳定性显著提升的突变株A.deccanensis YP-D8。通过进一步的生物信息学分析和基因敲除实验,我们发现基因组中的一个噬菌体来源的核酸内切酶VII是引起菌株遗传不稳定性的关键因素。这不但加强了我们对放线菌内遗传不稳定性分子机制的理解,还可以指导我们如何通过合理地改造来提高工业放线菌的遗传稳定性,有助于我们应对工业化生产过程中菌株频繁退化的挑战。本研究还利用转座子随机突变技术确定了A.deccanensis YP-D8中橙红色素的生物合成基因簇（opt）,敲除该基因簇可以阻断副产物橙红色素的合成,最终获得突变株A.deccanensis YP-D11。与野生型菌株YP-1相比,YP-D11在各方面表现出更好的性能,例如外源质粒转化效率更高、胞内能量（ATP）和还原力（NADPH/NADP+）水平提高、外源蛋白表达能力增强以及遗传稳定性提高等,因此,YP-D11可作为进一步提高非达霉素产量的优良底盘。此外,我们还在A.deccanensis YP-1中建立了CRISPR/Cas9胶内酶切偶联ExoCET克隆系统,并利用该系统成功克隆到完整的非达霉素生物合成基因簇（fad）。将该基因簇导入底盘菌株YP-D11后获得基因簇多拷贝菌株A.deccanensis YP-M6,该菌株中非达霉素产量可达到72.5 mg/L,是野生型菌株YP-1的3.2倍。在这基础上过表达途径特异性正调控基因fad R1构建非达霉素高效合成生物体系,最终筛选得到的高产菌株A.deccanensis YP-M7在YEME基础培养基和Y4工业培养基中非达霉素产量分别为331.1 mg/L和619.2 mg/L,较野生型菌株YP-1分别提高了13.5倍和26.0倍。同时,YP-M7菌株表现出较好的遗传稳定性,其非达霉素产量在连续传代10次后仍然保持相对稳定,因此该菌株有望用于大规模生产非达霉素,从而促进非达霉素的产业化进程。