昆虫的鱼尼丁受体是钙离子释放通道,是双酰胺类杀虫剂的主要作用靶标。为了研究昆虫对双酰胺类杀虫剂抗性的分子机制,本研究克隆得到了甜菜夜蛾、棉铃虫、二化螟、褐飞虱、灰飞虱和白背飞虱这六种常见农业害虫的鱼尼丁受体基因全长序列,并与相关昆虫的鱼尼丁受体氨基酸序列进行具体比较分析。本文通过比较本实验室连续多年筛选的甜菜夜蛾抗性品系和未接触过药剂的室内敏感品系中鱼尼丁受体基因氨基酸序列的差异,在抗性品系中没有发现抗性突变,仅有部分碱基多态性存在。然后深入研究了该基因mRNA表达水平的差异,发现该基因在抗性品系的不同发育阶段和不同组织中的相对表达水平均明显高于敏感品系。最后进一步分析抗、感品系的基因组DNA中鱼尼丁受体基因的相对水平差异,从而为研究甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性的分子机制提供依据。1.农业害虫的鱼尼丁受体基因全长cDNA的克隆为了从分子水平研究不同昆虫对双酰胺类杀虫剂敏感性差异的原因,本文主要克隆得到了甜菜夜蛾Spodoptera exigua、棉铃虫 Helicoverpa armigera、二化螟 Chilo suppressalis、褐飞虱 Nilaparvata lugens、灰飞虱 Laodelphax striatellus 和白背飞虱Sogatella furcifera这六种常见农业害虫的鱼尼丁受体基因的全长序列,它们的开放阅读框在15354-15408bp之间,编码的氨基酸长度在5118-5136之间,并与其他种类昆虫具有较高的同源性;通过对比不同种类昆虫间该基因的氨基酸序列及蛋白质结构域差异,发现六种昆虫的鱼尼丁受体都有相同的蛋白结构域,且鳞翅目和同翅目昆虫含有不同的低复杂区域(low-complexity region,LCR)。2.甜莱夜蛾抗氯虫苯甲酰胺品系鱼尼丁受体基因突变检测甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性品系在本实验室经过连续60代的连续筛选,其抗性倍数为244.6倍,达到极高水平抗性。本研究对甜菜夜蛾抗性品系与敏感品系鱼尼丁受体mRNA的ORF进行了测序与序列比对,大量单头甜菜夜蛾的鱼尼丁受体序列比对后发现鱼尼丁受体序列中存在大量的核苷酸碱基多态性,与敏感品系的序列比对后并没有发现稳定的靶标突变位点,说明该抗性品系对氯虫苯甲酰胺的极高水平抗性不是由该靶标突变引起的。3.甜菜夜蛾抗/感品系鱼尼丁受体基因的定量分析由于本实验室的氯虫苯甲酰胺抗性品系中未发现抗性突变,本研究通过实时荧光定量PCR对抗性品系与敏感品系间鱼尼丁受体基因的表达水平差异进行了分析。在甜菜夜蛾各发育阶段,以及幼虫各组织中均能检测到鱼尼丁受体的表达,卵、幼虫和蛹的表达量高于成虫期的表达量;幼虫各组织间以体壁中表达量最高,其次是马氏管,以脂肪体中表达量最低,抗性品系与敏感品系甜菜夜蛾具有相同的表达规律。抗性品系与敏感品系间鱼尼丁受体的表达水平差异显著,在甜菜夜蛾各发育阶段均是以抗性品系的表达量高于敏感品系,幼虫各组织中的表达量也是以抗性品系高于敏感品系,尤其是抗性品系体壁中鱼尼丁受体的相对表达量是敏感品系幼虫体壁表达量的2倍。鉴于甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性品系鱼尼丁受体基因的表达水平高于敏感品系,呈现出2倍的关系,并且各发育阶段与幼虫各组织均呈现同样的关系,我们对甜菜夜蛾抗性品系与敏感品系间鱼尼丁受体基因的相对拷贝数进行了定量测定。利用鱼尼丁受体基因的mRNA序列,分别在该基因的5未端和3未端设计了2对引物,分别对鱼尼丁受体基因的基因组拷贝数进行定量分析,结果发现,抗性甜菜夜蛾鱼尼丁受体基因的相对量刚好是敏感品系的2倍,2对在位置上相距甚远的引物(5末端和3末端)得到完全一致的结果,说明抗性种群的鱼尼丁受体基因可能发生了一次复制,这一结果与鱼尼丁受体基因的mRNA定量分析结果吻合,说明甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性与鱼尼丁受体复制有关,目前本研究正在寻找更加可靠可行的方法对此作深入研究,为研究甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性的分子机制提供依据。