【摘 要】
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CRISPR/Cas9技术是基于细菌二型CRISPR免疫系统发展起来的基因组定点靶向技术。该技术在生物医学和转基因研究方面有着广阔的应用前景。相比ZFN和TALEN技术,CRISPR/Cas9系统
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CRISPR/Cas9技术是基于细菌二型CRISPR免疫系统发展起来的基因组定点靶向技术。该技术在生物医学和转基因研究方面有着广阔的应用前景。相比ZFN和TALEN技术,CRISPR/Cas9系统是一个RNA导向的基因组打靶技术,具有类似的打靶效率,且更易于操作,能够同时实现多基因编辑,具有更强的扩展性。而目前利用CRISPR/Cas9技术进行多基因打靶的常用方法是将多个gRNA表达盒同时构建到一个载体中表达,但是多gRNA表达盒载体不但构建麻烦,而且能同时表达的gRNA有限。本研究开发了一种简单有效的方法来人工组装CRISPR重复序列。该方法是通过模拟嗜热链球菌的CRISPR序列,利用同尾酶的兼容性特点逐步组装了多个CRISPR重复间隔序列,解决了目前商业化合成含有四个或以上Repeat(36 bp)的CRISPR序列的技术难点。本研究中,首先克隆了嗜热链球菌的CRISPR3/Cas基因簇,然后组装了含有不同spacer的CRISPR序列,构建了靶向卡那抗性基因三个不同位点的CRISPR表达载体,最后通过电转化三种不同的大肠杆菌对其进行功能验证,所得打靶效率可高达95%。
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