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目的:宫颈癌（cervical cancer,CC）是威胁全球妇女生命安全的最重要的恶性肿瘤之一,尽管全球范围对宫颈癌早期筛查均投入巨大,但其发病率和死亡率仍居高不下。早期诊断宫颈癌有效的临床干预可明显改善生存,但晚期及复发转移的宫颈癌目前尚缺乏精准的预测方法以及治疗手段。因此,揭示宫颈癌发生的关键分子机制,探索早期诊断的特异性分子标志物,实施精准治疗和预后评估均具有重大的临床价值。环状RNAs（Circular RNAs,circ RNAs）作为一种具有闭环共价结构的非编码RNA,因稳定性强且具有高度保守的组织及时空特异性,其在肿瘤诊断、评估预后以及靶向治疗等方面的作用逐渐受到关注。结构上因含有mi RNA结合位点,能够吸附并解除mi RNA对靶基因表达的抑制作用,形成ce RNA调节机制,影响肿瘤的发生发展。目前已有少量的circ RNAs在宫颈癌中的作用机制被报道。然而,相对于数量庞大且功能各异的circ RNAs,针对其在宫颈癌诊断及作用机制方面的研究仍有欠缺。因此,本研究利用课题组前期宫颈癌芯片筛查结果与GEO公共数据集联合分析,找到宫颈癌组织中异常高表达的circ RNA,并对其调控宫颈癌进程的分子机制开展深入研究,为寻找宫颈癌早期诊断的分子标记物及有效治疗靶点提供理论基础。研究方法:首先应用本课题组前期宫颈癌芯片筛查结果与GEO公共数据库中GSE90737宫颈癌circ RNA表达谱数据进行联合分析,确定circ RPL13研究候选分子。以ce RNA机制为基础,利用在线预测软件,通过生物信息学构建ce RNA网络,筛选circ RPL13/mi R-1285-3p/TLN1作为研究目标。利用RT-q PCR实验验证宫颈癌组织中配对的癌和癌旁正常组织中circ RPL13、mi R-1285-3p及TLN1的表达情况。ROC曲线评价circ RPL13对宫颈癌的诊断价值。利用蛋白免疫印迹方法（Western blot）检测配对的宫颈癌和癌旁正常组织中TLN1表达。Spearman相关性分析及多元线性回归分析评价circ RPL13、mi R-1285-3p及TLN1表达相关性。非参数检验分析circ RPL13、mi R-1285-3p及TLN1与临床病理特征的相关性。单因素方差分析评价circ RPL13、mi R-1285-3p及TLN1与淋巴结转移的关系。在体外实验中,利用RT-q PCR检测不同宫颈癌细胞系中circ RPL13表达;利用RNA FISH实验明确circ RPL13在细胞中的亚定位。构建circ RPL13的干扰片段,利用转染技术沉默细胞内circ RPL13表达,RT-q PCR验证转染效率。通过CCK-8实验、Ed U实验检测circ RPL13对细胞增殖能力的影响,采用划痕实验以及Transwell实验检测circ RPL13对宫颈癌细胞系迁移侵袭能力的影响。利用mi R-1285-3p mimic及inhibitor转染细胞,RT-q PCR验证转染效率。利用双荧光素酶报告基因实验检测circ RPL13与mi R-1285-3p之间结合关系。采用RT-q PCR检测转染si-circ RPL13的宫颈癌细胞中mi R-1285-3p表达水平,明确调控关系。在si-circ RPL13与mi R-1285-3p inhibitor共转染细胞后,采用CCK-8、Ed U和Transwell等实验检测circ RPL13通过吸附结合mi R-1285-3p对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。通过双荧光素酶报告基因实验检测mi R-1285-3p与TLN1之间结合关系。采用RT-q PCR及Western blot检测转染si-circ RPL13、mi R-1285-3p mimic以及si-circ RPL13+mi R-1285-3p inhibitor的宫颈癌细胞检测TLN1表达水平,明确调控关系。构建沉默TLN1表达的宫颈癌细胞系,通过si-TLN1转染及si-TLN1和mi R-1285-3p inhibitor共转染,采用CCK-8、Ed U和Transwell等实验检测mi R-1285-3p通过调节TLN1对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果:1、利用课题组前期的宫颈癌组织芯片筛查结果联合GEO公共数据库中的宫颈癌组织芯片数据集,分析发现12种异常高表达的circ RNAs,通过数据处理、分析、整合及对差异表达的circ RNAs亲本基因来源及特征进行分析,选取circ RPL13作为研究靶点。进而围绕探索circ RPL13作用机制展开,利用在线预测构建ce RNA网络,发现mi R-1285-3p为circ RPL13的候选靶基因,TLN1为mi R-1285-3p靶基因,并获取了对应的结合位点。组织实验表明,circ RPL13在宫颈癌组织中的表达水平明显高于配对的癌旁正常组织（P＜0.01）,且预测宫颈癌和非癌组织的AUC为0.750（CI:0.635-0.866）,预测的灵敏度为72.2%,特异性为77.8%。mi R-1285-3p在宫颈癌组织的表达明显低于癌旁正常组织（P＜0.05）,TLN1在宫颈癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织（P＜0.01）。单因素分析显示,在宫颈癌组织中circ RPL13与mi R-1285-3p的表达呈显著负相关,差异有统计学意义（R=-0.56,P＜0.01）,circ RPL13与TLN1的表达呈显著正相关（R=0.46,P＜0.01）,而mi R-1285-3p与TLN1的表达呈显著负相关（R=-0.53,P＜0.01）。多元线性回归发现TLN1 m RNA相对表达量与circ RPL13及mi R-1285-3p均有明显相关（P=0.009,P=0.046）。相关性分析显示circ RPL13和TLN1的相对表达水平与淋巴结转移正相关,而mi R-1285-3p的相对表达水平与淋巴结转移负相关。2、体外细胞实验中,我们发现circ RPL13在宫颈癌细胞系中高表达,其中Si Ha和Ca Ski细胞更为显著（P＜0.01）,且主要定位于细胞质中。在Si Ha和Ca Ski细胞中转染circ RPL13的si RNA,可以显著降低细胞内的circ RPL13的表达。CCK-8及Ed U实验结果显示沉默circ RPL13的表达能够明显抑制Si Ha和Ca Ski细胞的增殖能力（P＜0.001,P＜0.01）;划痕及Transwell实验结果显示沉默circ RPL13的表达能够明显抑制Si Ha和Ca Ski细胞的迁移及侵袭能力（P＜0.01,P＜0.05）。mi R-1285-3p mimic及inhibitor转染Si Ha和Ca Ski后可显著调控mi R-1285-3p的表达（P＜0.001,P＜0.01）。双荧光素酶报告基因实验显示过表达mi R-1285-3p可以抑制circ RPL13-wt组荧光素酶报告基因活性（P＜0.01）,而circ RPL13-mut组荧光素酶报告基因活性无显著改变（P＞0.05）。沉默circ RPL13表达后mi R-1285-3p表达水平明显升高（P＜0.01）。共转染mi R-1285-3p inhibitor和si-circ RPL13可以明显逆转沉默circ RPL13表达对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制作用。双荧光素酶实验证实mi R-1285-3p与TLN1 3’UTR区存在结合关系,过表达mi R-1285-3p可以抑制TLN1 3’UTR-wt组荧光素酶报告基因活性（P＜0.01）,而不能抑制TLN1 3’UTR-mut组荧光素酶报告基因活性（P＞0.05）。RT-q PCR和Western blot实验结果显示沉默circ RPL13及过表达mi R-1285-3p均能使Si Ha和Ca Ski细胞中TLN1的表达降低（P＜0.01）,而沉默mi R-1285-3p表达可部分逆转沉默circ RPL13对TLN1的表达抑制作用（P＜0.01）。构建沉默TLN1表达的宫颈癌细胞,RT-q PCR及Western blot实验结果显示,TLN1m RNA及蛋白表达明显降低（P＜0.001）。CCK-8及Ed U实验结果显示沉默TLN1的表达能够明显抑制Si Ha和Ca Ski细胞的增殖能力（P＜0.01）;划痕及Transwell实验结果显示沉默TLN1的表达能够明显抑制Si Ha和Ca Ski细胞的迁移及侵袭能力（P＜0.01）。而共转染mi R-1285-3p inhibitor后可明显逆转沉默TLN1表达对Si Ha和Ca Ski的增殖及转移抑制作用（P＜0.01,P＜0.05）。结论:1、通过本课题组前期组织芯片与GEO公共数据集联合分析,筛选circ RPL13作为研究靶点。生物信息学方法筛选出circ RPL13/mi R-1285-3p/TLN1可能在宫颈癌中存在调控作用。组织实验证实circ RPL13在宫颈癌中高表达且在区别宫颈癌和非癌组织中具有较好的预测能力,TLN1同样在宫颈癌中高表达,而mi R-1285-3p在宫颈癌中低表达。circ RPL13对TLN1是正向作用关系,而mi R-1285-3p对TLN1是负向作用关系。且circ RPL13与TLN1的表达水平与淋巴结转移正相关,mi R-1285-3p表达水平与淋巴结转移显著负相关。说明circ RPL13、mi R-1285-3p及TLN1可能存在内源性竞争关系,参与宫颈癌的疾病进程。2、circ RPL13在宫颈癌细胞系中高表达且主要定位于细胞质;circ RPL13促进宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭。降低circ RPL13的表达能够显著抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。3、circ RPL13吸附结合mi R-1285-3p,解除mi R-1285-3p对靶基因TLN1的抑制,从而上调TLN1的表达,进而影响宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。