类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种常见的自身免疫性疾病,该病主要以关节和滑膜的慢性炎症为特征,严重影响患者的生活质量。作为一群专职辅助B细胞的CD4+T细胞亚群,滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells,Tfh）在B细胞分化、抗体产生和类别转换过程中发挥关键作用。在RA发病过程中,异常活化的Tfh细胞可调控B细胞分泌大量自身抗体,加剧疾病进展。细胞分泌的小胞外囊泡（small extracellular vesicles,sEVs）被证实能够选择性携带来源细胞的特定组分,参与细胞间的信号传递。然而,Tfh细胞能否通过分泌sEVs调控B细胞产生自身抗体,进而影响RA发病过程,目前未见相关报道。目的本研究旨在探讨Tfh细胞来源的sEVs（Tfh-sEVs）在B细胞分化和抗体产生过程中的作用,寻找Tfh-sEVs调控B细胞应答的关键功能分子并揭示其调控机制。观察Tfh细胞来源sEVs对小鼠胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）发病的影响,评估患者血浆中Tfh样-sEVs在RA疾病中的潜在应用价值。方法1.分析Tfh细胞来源的sEVs在B细胞分化和抗体产生中的作用采用卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）免疫小鼠,免疫磁珠法联合流式细胞术（flow cytometry,FCM）分选小鼠脾脏中Tfh细胞（CD4+CD19-CXCR5+GITR-）、non-Tfh细胞（CD4+CD19-CXCR5-GITR-）和B细胞。将Tfh细胞或non-Tfh细胞与B细胞共培养,FCM检测培养体系中生发中心（germinal center,GC）样B细胞（CD19+Ig G1+GL-7+）和浆母细胞（CD19+CD138+）的比例,酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测培养上清中总Ig G和抗OVA抗体的含量。体外培养Tfh细胞,收集Tfh细胞培养上清（Tfh cell-culture supernatant,Tfh-SN）,利用抗CD63磁珠去除培养上清中sEVs,获得部分去除sEVs的Tfh细胞培养上清(Tfh-SNsEVs-depleted),并将其加入B细胞培养体系。培养3天后,FCM检测培养体系中GC样B细胞和浆母细胞的比例。收集B细胞培养上清,ELISA检测上清中总Ig G和抗OVA抗体的含量。收集Tfh细胞培养上清,经过超速离心后,采用Exo Quick试剂盒制备Tfh-sEVs。利用透射电镜进行sEVs形态学观察,Western blot检测sEVs特征性蛋白,FCM检测sEVs表面分子表达。将红色DIR荧光染料标记的Tfh-sEVs加入B细胞培养体系,激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy,CLSM）观察Tfh-sEVs与B细胞的结合情况,在此基础上,利用抗淋巴细胞功能相关分子1（lymphocyte function-associated antigen 1,LFA-1）封闭抗体预处理Tfh-sEVs,观察LFA-1分子在sEVs与B细胞结合过程中的作用。将Tfh-sEVs加入B细胞培养体系,以non-Tfh细胞来源的sEVs（non-Tfh-sEVs）作为对照,FCM检测培养体系中GC样B细胞和浆母细胞的比例,ELISA检测培养上清中总Ig G和抗OVA抗体的含量。利用sEVs分泌调控蛋白Rab27a的sh RNA慢病毒表达载体转染Tfh细胞,敲减Rab27a的表达后,观察Tfh细胞分泌sEVs的变化。将Rab27a敲减的Tfh(TfhRab27a sh RNA)细胞过继转移至裸鼠体内,采用OVA免疫裸鼠,第8天处死裸鼠,利用ELISA检测血清中抗OVA抗体的含量,酶联免疫斑点测定法（enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT）检测脾脏中OVA特异性抗体分泌细胞的数量,FCM检测脾脏GC B细胞和浆细胞的比例,以及滤泡区B细胞（folicular B cell,FOB）/边缘区B细胞（marginal zone B cell,MZB）的比值。制备脾脏石蜡切片,HE染色,观察脾脏生发中心的形成情况。2.探讨CD40L在Tfh-sEVs调控B细胞分化和抗体产生中的作用及其调控机制Western blot和FCM检测Tfh-sEVs上CD40L的蛋白表达。将CD40L封闭抗体预处理的Tfh-sEVs加入B细胞培养体系,FCM检测培养体系中GC样B细胞和浆母细胞的比例,ELISA检测上清中总Ig G和抗OVA抗体的含量。Western blot检测Tfh细胞和Tfh-sEVs中分拣连接蛋白SNX27的蛋白表达,CLSM观察Tfh细胞中SNX27和CD40L的共定位情况,免疫共沉淀技术（co-immunoprecipitation,Co-IP）分析两种蛋白的相互作用。利用SNX27 sh RNA慢病毒表达载体转染小鼠T淋巴瘤EL-4细胞系,敲减SNX27的表达后,FCM和Western blot检测EL-4SNX27 sh RNA细胞和其来源sEVs中CD40L的表达变化。利用溶酶体功能抑制剂Bafilomycin A1（BAF）处理EL-4SNX27 sh RNA细胞,FCM和Western blot检测BAF处理对EL-4SNX27 sh RNA细胞和其来源sEVs中CD40L蛋白表达的影响。3.探究Tfh细胞来源sEVs在CIA小鼠发病中的作用构建CIA小鼠模型,观察小鼠足趾关节红肿程度。制备小鼠关节切片,HE染色,观察关节的病理学改变。FCM检测CIA小鼠脾脏和淋巴结Tfh细胞、GC B细胞和浆细胞的比例,ELISA检测小鼠血清抗鸡II型胶原（type II collagen,CII）抗体的含量。采用鸡CII免疫小鼠,免疫磁珠法联合FCM分选脾脏中Tfh细胞和non-Tfh细胞,在CIA造模过程中将Tfh细胞或non-Tfh细胞过继转移至小鼠体内,观察小鼠足趾关节红肿程度,记录各组小鼠发病率、平均受累关节数和关节评分。制备关节切片,HE染色,观察各组小鼠关节的病理学改变。FCM检测各组小鼠脾脏和淋巴结中Tfh细胞、GC B细胞和浆细胞的比例,ELISA检测各组小鼠血清中抗CII抗体的含量。为了解Tfh细胞分泌的sEVs在CIA疾病进展中的作用,我们首先利用Exo ELISA法测定CIA小鼠脾脏来源Tfh细胞sEVs的分泌量。将TfhRab27a sh RNA细胞过继转移至CIA小鼠,观察在减少sEVs分泌后,Tfh细胞对疾病的影响。4.观察ICOS信号对Tfh-sEVs分泌和功能的影响FCM检测CIA小鼠脾脏和淋巴结中Tfh细胞以及non-Tfh细胞上ICOS的表达水平,以及ICOSL在GCB细胞上的表达量。在抗CD3抗体存在的情况下,加入抗ICOS抗体,培养Tfh细胞和non-Tfh细胞,收集培养上清,Exo ELISA法分析抗ICOS抗体对Tfh细胞和non-Tfh细胞分泌sEVs能力的影响。同样情况下,利用Western blot检测分析抗ICOS抗体对Tfh细胞中AKT磷酸化水平的影响。在抗CD3和抗ICOS抗体活化条件下,利用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002/Wortmannin处理Tfh细胞24h,收集培养上清,Exo ELISA法检测Tfh细胞sEVs的分泌量。体外培养Tfh细胞,在抗CD3和抗CD28抗体活化条件下加入抗ICOS抗体刺激,48h后提取Tfh-sEVs,Western blot检测Tfh细胞和Tfh-sEVs上CD40L的蛋白表达。将这种Tfh-sEVs加入B细胞培养体系,FCM检测培养体系中GC样B细胞和浆母细胞的比例,ELISA检测上清中总Ig G和抗CII抗体的含量。5.评估血浆Tfh样-sEVs在RA疾病中的潜在应用价值收集RA患者和健康对照者血浆,ELISA检测血浆中s CD40L蛋白含量,分析其与RA关节疾病活动度评分（disease activity scores in 28 joints,DAS28）、类风湿因子（rheumatoid factor,RF）以及抗环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide,CCP）抗体水平的相关性。提取RA患者和健康对照者血浆中sEVs,根据Tfh细胞表面分子特征,我们将CD4+CXCR5+sEVs定义为Tfh样-sEVs,利用FCM检测血浆中Tfh样-sEVs的比例,以及Tfh样-sEVs表面CD40L的表达量,并分析其与DAS28、RF以及抗CCP抗体水平的相关性。结果1.在T-B细胞体外共培养体系中,与non-Tfh细胞相比,Tfh细胞与B细胞培养组中GC样B细胞和浆母细胞的比例明显增加,总Ig G和抗OVA抗体水平显著升高。Tfh细胞培养上清可增加B细胞培养体系中GC样B细胞和浆母细胞的比例,以及上清中总Ig G和抗OVA Ig G的含量。当去除Tfh-SN中sEVs后,培养体系中GC样B细胞和浆母细胞的比例下降,上清中总Ig G和抗OVA抗体的含量明显减少。Tfh-sEVs在电镜下呈茶托样结构,粒径介于50-150nm之间,表达sEVs特征性分子CD63、CD9、HSP70和TSG101,表面表达CD4、CXCR5、CD40L、ICOS和LFA-1。红色DIR荧光染料标记的Tfh-sEVs加入B细胞培养体系4h后,84.95±3.00%的B细胞中呈现红色荧光。而当Tfh-sEVs上的LFA-1被抗体封闭后,再加入B细胞培养体系,仅有14.95±9.15%的B细胞呈现红色荧光,结果提示Tfh-sEVs能够与B细胞结合,且依赖于LFA-1分子。在B细胞培养体系中加入Tfh-sEVs后,培养体系中GC样B细胞和浆母细胞的比例显著上升,上清中总Ig G和抗OVA抗体的含量明显增加。Rab27a敲减后,Tfh细胞分泌sEVs的能力显著降低。与TfhNC sh RNA细胞相比,TfhRab27a sh RNA细胞过继转移组裸鼠脾脏生发中心明显缩小,脾脏GC B细胞和浆细胞比例明显下降,FOB/MZB的比值显著降低,血清中抗OVA抗体含量以及脾脏OVA特异性抗体分泌细胞的数量显著减少。上述结果表明,Tfh细胞在体内外可通过sEVs促进B细胞分化和抗体产生。2.Tfh-sEVs表达CD40L,且CD40L的表达量明显高于non-Tfh-sEVs。利用抗体封闭Tfh-sEVs上CD40L后,Tfh-sEVs促进B细胞分化和抗体产生的能力明显减弱。Tfh细胞和Tfh-sEVs中均表达分拣连接蛋白SNX27。利用CLSM观察,发现SNX27与CD40L在Tfh细胞中存在共定位;Co-IP结果显示,SNX27与CD40L存在相互结合。在小鼠EL-4细胞中探究SNX27对CD40L表达的调控作用,结果显示,SNX27敲减的EL-4(EL-4SNX27 sh RNA)细胞及其分泌的sEVs上CD40L的表达显著降低。使用溶酶体功能抑制剂BAF处理EL-4SNX27 sh RNA细胞后,细胞上CD40L的表达恢复至原有水平,但其来源sEVs上的CD40L仍然呈现低水平表达,表明在阻断细胞溶酶体途径,胞内CD40L稳定表达情况下,敲减SNX27可直接减少sEVs上CD40L的表达。以上结果表明,Tfh-sEVs体外促进B细胞分化和抗体产生依赖于表面的CD40L分子,且SNX27直接调控sEVs上CD40L的表达。3.CIA小鼠淋巴结中Tfh细胞的比例和数量显著增加,血清抗CII抗体水平明显上升。过继转移Tfh细胞后,CIA小鼠的发病率和疾病评分升高,平均受累关节数增加,脾脏和淋巴结中Tfh细胞、GC B细胞和浆细胞的数量增加,血清抗CII抗体水平升高。CIA小鼠脾脏来源Tfh细胞分泌sEVs的能力显著增强。当减少sEVs的分泌后,TfhRab27a sh RNA细胞过继转移组小鼠CIA的发病率和疾病评分明显低于对照组,平均受累关节数减少,脾脏和淋巴结中浆细胞的数量减少,血清抗CII抗体水平降低。以上结果表明,Tfh细胞能够促进CIA疾病进展,减少sEVs的分泌后,Tfh细胞对CIA疾病进展的促进作用明显减弱。4.在CIA小鼠中,脾脏及淋巴结Tfh细胞上ICOS的表达量分别是non-Tfh细胞的4.5倍和5.3倍。与WT小鼠相比,CIA小鼠脾脏和淋巴结中Tfh细胞上ICOS的表达量显著增加。在CIA疾病进展过程中,小鼠脾脏和淋巴结中GC B细胞上ICOSL呈现高水平表达。抗ICOS抗体刺激后,Tfh细胞分泌sEVs的能力显著增强,且明显强于non-Tfh细胞。抗ICOS抗体刺激后,Tfh细胞AKT磷酸化水平升高。PI3K/AKT通路抑制剂LY294002/Wortmannin处理后,Tfh细胞分泌sEVs的数量减少,胞内AKT的磷酸化水平降低,Rab27a蛋白表达下降。抗ICOS抗体刺激Tfh细胞后,Tfh细胞和Tfh-sEVs上CD40L的表达量显著增加,Tfh-sEVs促进B细胞向浆母细胞分化的能力显著提升,促进B细胞分泌总Ig G和抗CII抗体的能力明显增强。以上结果表明,在小鼠CIA发病过程中,上调的ICOSL/ICOS信号能促进Tfh细胞释放sEVs,并增强其功能。5.RA患者血浆中s CD40L蛋白含量显著高于健康对照者,但RA患者血浆中s CD40L蛋白含量与DAS28评分、RF以及抗CCP抗体水平无相关性。RA患者血浆中Tfh样-sEVs的比例,以及Tfh样-sEVs表面CD40L的表达量显著高于健康对照者,且与DAS28评分、RF以及抗CCP抗体水平呈正相关关系。结论sEVs是Tfh细胞促进B细胞分化和抗体产生的重要组分,CD40L是其发挥作用的关键分子,分拣连接蛋白SNX27可直接调控sEVs上CD40L的表达。小鼠CIA发病过程中,上调的ICOS信号能促进Tfh细胞释放sEVs,Tfh细胞通过大量释放sEVs增强B细胞免疫应答,加剧疾病进程。人血浆中Tfh样-sEVs的比例,以及Tfh样-sEVs表面CD40L的表达量可作为RA疾病活动度的潜在评价指标。