第一部分：结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究
　　目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6DNA疫苗，并对其在体外真核细胞及C57BL/6小鼠中表达，初步探究这两种DNA疫苗的免疫原性。方法从GenBank中获取M.tuberculosisH37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列送生工合成。然后经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组，测序鉴定正确后应用TIANGEN试剂盒大量纯化无内毒素的质粒DNA。体外转染验证其表达后，免疫C57BL/6小鼠，检测特异性细胞免疫应答，流式检测升高细胞因子所属细胞亚型。结果Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6DNA疫苗在体内外均能表达。体外WesternBlot检测显示，DNA疫苗体外转染293T细胞24h可以检测到蛋白Hsp65、Ag85B、ESAT6的表达，48h时细胞内蛋白表达量达最高。C57BL/6小鼠中Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6DNA疫苗激起了很好的免疫反应，可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答。结论Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6DNA疫苗都具有较强的免疫原性，呈Th型细胞介导的免疫应答；Hsp65-Ag85BDNA疫苗的保护效力比Hsp65-ESAT6DNA疫苗强，有待进一步研究其应用价值。
　　第二部分：卡介苗ureC基因缺失株的构建及筛选
　　目的在MTB中ureC产生的氮被认为是碱化MTB生存微环境的重要来源，不仅可以预防吞噬体的酸化，还可阻止吞噬体和溶酶体的融合，进一步逃脱免疫监视和免疫反应。运用Cre/LoxP同源重组方法对卡介苗进行遗传操作，缺失卡介苗中氮源基因ureC，打破MTB在体内原有适宜生存的微环境，促进吞噬-溶酶体成熟，筛选并获得卡介苗ureC基因缺失株，为后续在此缺失株添加有效的MTB免疫抗原提供基础。方法采用Cre/LoxP同源重组的方法，将含有重组酶的pSL002质粒电转至卡介苗中，涂板，长出单菌落后以此菌落做感受态。利用speⅠ和NsiⅠ双酶切本实验室前期构建的含有ureC基因左右同源臂及gfp荧光蛋白的重组质粒pSL001，获得目的片段，并将其电转至上述含有pSL002质粒的卡介苗，涂板后挑取单克隆，通过菌液PCR进行鉴定、筛选出卡介苗中双交换目的片段并缺失ureC基因的菌株，从而获得卡介苗ureC基因缺失株。结果电转至含有pSL002质粒卡介苗的目的片段，因为存在gfp蛋白，在蓝光手电筒下发绿色荧光，包括单交换与双交换两种，对发绿色荧光单菌落进行菌液PCR，琼脂糖凝胶鉴定，单交换菌落在1734bp处出现条带，双交换菌落因片段过大在3498bp处隐约有条带或不出现条带。挑取双交换菌落涂板传代，成功筛选出了卡介苗ureC基因缺失株，形态正确，并能够稳定传代。结论利用Cre/LoxP同源重组方法在卡介苗中进行遗传操作，能够对卡介苗的基因进行无缝敲除，并且获得的突变株能够稳定传代。研究表明，在此过程中采用Cre/LoxP同源重组系统可大大提高了MTB的重组效率并缩短了重组时间，为重组卡介苗的研究提供了便利。