前言:人脑胶质瘤（Glioma）是组织学分类中起源于神经上皮外胚层的一种原发性中枢神经系统恶性肿瘤,在原发性的脑内肿瘤中占比达50%以上,是全球范围内发病率占居首位且无法完全治愈的颅内肿瘤类型,也是最难攻克的颅内肿瘤。总体而言,胶质瘤患者复发率高,五年生存率不足5%,预后极其不佳。脑胶质瘤没有真性包膜,常表现为似树根状钻入正常脑组织的弥漫性浸润生长,临床手术中常难以辨别肿瘤组织和周边正常脑组织的边界。因而目前针对胶质瘤的临床治疗,是在保全基本神经功能和患者生活治疗的前提下借助神经导航等精确定位设备最大安全程度地对肿瘤进行手术切除,术后辅助规范的放疗和同步替莫唑胺化疗,以及根据具体情况实施免疫治疗等。但由于脑胶质瘤异质性强、术后放化疗敏感性不一、血脑屏障对药物的天然屏障作用等特点,使得其治疗效果不甚满意,患者的总体预后无明显改善。近几十年的研究陆续证实了肿瘤的基因组学对胶质瘤的预后有明显影响,特定基因通路改变可能对胶质瘤在大脑中的侵袭和扩散起重要作用,但对于其具体的生物学功能和其调控下游信号通路的机制仍不明确。对于胶质瘤发生和分子机制演进的深入研究将对有针对性的个体化治疗及患者预后评估都具有重要的理论意义和临床实用价值。细胞内的关键骨架调节蛋白的异常激活或者失活很大程度上导致了机体细胞中正常生物学行为的肿瘤性转化。近期研究证实,与Cas L相互作用的分子家族（MICALs）参与了细胞骨架动力学和相关生物学过程的调节,该家族在进化上高度保守,代表一系列多结构域蛋白,可以分为两个亚家族:MICAL（MICAL-1、MICAL-2、MICAL-3）和MICALL（MICAL-Like,MICAL-L1、MICAL-L2）。MICAL-L2（微管相关单加氧酶样蛋白2）,也被称为Rab13结合蛋白（JRAB）,是该家族的重要成员之一,研究发现MICAL-L2可以参与细胞骨架重排的控制并介导蛋白的内吞再循环和紧密连接的形成。目前对MICAL-L2功能的大多数了解都来自于细胞生物学研究,而其在人类疾病中的角色知之甚少。既往研究发现MICAL-L2高表达于非小细胞肺癌、卵巢癌、胃癌中,调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。表皮生长因子受体（EGFR）是Erb B家族的成员,已被证实在多种肿瘤中的发生发展中发挥重要作用。在胃癌中,MICAL-L2抑制溶酶体介导的EGFR降解,增强胃癌细胞的迁移能力,即MICAL-L2具有阻止其下游蛋白降解的功能,可能在胃癌中发挥致癌作用。基于课题组长期以来对胶质瘤内细胞骨架调节动力学和微管动力学的关注,我们发现了MICALs这一尚未在胶质瘤中进行过研究的家族。通过多数据平台胶质瘤数据的整合分析,于该家族中筛选出具有唯一一个普遍临床预后价值的基因,即MICAL-L2,并以本科室临床手术标本中进行验证。以多数据平台综合分析结果为指导和切入点,通过细胞功能学阐述MICAL-L2在胶质瘤中所涉及的病理活动,并解析其所涉及的具体作用机制和信号调控,以期为胶质瘤的不良预后提供新的解决方案。目的:1.评估分析MICAL-L2在人脑胶质瘤中的临床价值;2.研究临床胶质瘤患者肿瘤组织中MICAL-L2的表达水平与病理分级之间的相关性;3.探索不同种类胶质瘤细胞株中MICAL-L2对其生物学行为的影响;4.进一步探究分析MICAL-L2影响胶质瘤恶性生物学表型的相关分子机制。研究方法:1.生物信息学方法:从全球癌症基因组图谱数据库（TCGA）和中国神经胶质瘤基因组图谱数据库（CGGA）这两个公开的数据平台获取所需胶质瘤的相关数据,对MICALs家族成员进行临床价值分析,经由Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验评估高低MICAL-L2表达组间的预后差异,并进行分级分类差异表达量分析,筛选出最具预后价值和研究意义的分子。通过基因富集分析（GSEA）和Glio Vis胶质瘤数据平台对差异表达MICAL-L2所涉及的相关生物学行为进行预测,通过KEGG分析MICAL-L2可能调控的分子信号通路。2.免疫组织化学方法利用免疫组织化学方法直观表现不同病理级别的胶质瘤细胞如低级别的Ⅱ级胶质瘤细胞和高级别Ⅲ级或Ⅳ级胶质母细胞瘤以及因颅脑外伤或癫痫切除之病灶组织的非肿瘤性脑组织中MICAL-L2的表达情况,更深一步表明MICAL-L2和胶质瘤细胞的发生发展以及恶性程度密切相关。3.细胞培养人胶质瘤细胞株U87、U373、U251、LN229、T98G及人类星形胶质细胞株NHA使用高糖DMEM+10%FBS+1%青霉素/链霉素双抗的完全培养基进行培养。由本实验室所提取的患者来源的原发性胶质瘤细胞株PGC21,PGC2410%使用10%胎牛血清+1%青/链霉素的RPMI1640培养基进行培养。所有细胞株都置于相对湿度为90%、含5%CO2以及恒温37°C的孵箱中培养。4.Real-time QPCR以TRIzol法和Takara快速RNA提取试剂盒分别提取不同胶质瘤组织和细胞之总RNA,进行RNA定量及逆转录获取对应的c DNA,随后以SYBR荧光标记进行三步法PCR反应。5.蛋白免疫印迹（Western blot）用RIPA蛋白裂解液于冰上提取不同胶质瘤组织和细胞之总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,随后进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、免疫杂交反应、ECL发光定影检测6.基因表达编辑以人胶质瘤细胞系LN229和人源性原代胶质瘤细胞株PGC21为研究对象,使用RNA干扰技术构建MICAL-L2敲低之细胞模型;以人胶质瘤细胞系U87和人源性原代胶质瘤细胞株PGC24为研究对象,使用携带过表达MICAL-L2质粒的慢病毒构建过表达组细胞模型;嘌呤霉素筛选稳转之敲减和过表达MICAL-L2细胞株。7.胶质瘤细胞体外功能学实验通过MTS细胞增殖实验、EDU成像检测、平板克隆实验检测MICAL-L2对不同胶质瘤模型增殖能力和细胞活力的影响;通过细胞凋亡之Tunel实验检测不同MICAL-L2表达水平下胶质瘤细胞的凋亡情况;以Transwell实验和Matrigel基质胶模型检测不同处理条件下MICAL-L2对胶质瘤细胞体外迁移和侵袭能力的影响。8.统计分析本研究中,使用Graph Pad Prism 8.0和SPSS 22.0进行统计分析,单因素方差分析（ANOVA）,双尾t检验分别应用于相应条件。所有数据统计分析结果以平均值±标准差SD表示,除非另有说明,否则双尾p<0.05作为判定标准被认为在统计学上存在显著性差异,即具有统计学意义。其中*P<0.05;**P<0.01;***P<0.005,****P<0.001,ns:P≥0.05。结果:1.多个胶质瘤数据库的综合数据分析显示MICAL-L2具有极其稳定的预后价值。（1）TCGA数据平台提取之胶质瘤生存预后数据对细胞骨架调节蛋白MICALs家族的五个分子进行差异分析,提示:该家族中只有MICAL-L2在全级别胶质瘤和GBM中具有稳定的表达差异和预后意义;（2）胶质瘤全级别生存曲线和分级别生存曲线均提示MICAL-L2的表达量显著影响胶质瘤患者的生存时间。GBM中无论是否发生甲基化,高表达MICAL-L2患者较低表达者预后差;低表达MICAL-L2且不伴有1p/19q共缺失的患者预后较高表达组差。（3）不论是CGGA还是TCGA数据库中,MICAL-L2表达量和胶质瘤的病理级别呈正相关。且在以GBM为代表的间充质亚型中,MICAL-L2的表达量明显高于其他亚型胶质瘤;此外,无论是LGGs还是HGGs中MICAL-L2在IDH1野生型胶质瘤中的表达量较突变型均显著增加。2.MICAL-L2在不同临床病理级别的胶质瘤组织中存在表达差异;取各级别胶质瘤组织和非肿瘤脑组织行免疫组织化学实验、mRNA和蛋白水平检测,结果显示随着胶质瘤恶性程度的增强MICAL-L2的表达量呈递增趋势。3.生物学效应的预测分析。GO分析提示,MICAL-L2在与胶质瘤细胞外基质的形成细胞骨架结构的调控密切相关;GSEA分析进一步提示MICAL-L2主要与细胞黏附作用、凋亡坏死相关。4.干扰MICAL-L2的表达可以影响不同来源胶质瘤细胞的增殖能力。应用MTS细胞增殖实验和EDU胞内增殖相关产物成像实验对胶质瘤细胞株LN229和人源性胶质瘤原代细胞株PGC21干扰MICAL-L2表达前后的细胞体外增殖能力进行检测,实验结果均揭示MICAL-L2敲低干扰组较对比组细胞的增殖活力明显减弱;集落形成实验显示进行MICAL-L2基因干扰编辑后,相比于对照组,干扰处理组的肿瘤细胞克隆集落形成量明显减少,直观提供了高表达MICAL-L2可促进细胞增殖能力的证据。5.MICAL-L2的表达抑制可促进不同来源胶质瘤细胞的凋亡Tunel凋亡实验结果提示:MICAL-L2表达的敲减处理使得肿瘤细胞内发生凋亡现象的细胞数增加,说明MICAL-L2可抑制胶质瘤细胞发生凋亡。6.MICAL-L2的表达抑制可降低不同来源胶质瘤细胞的体外迁移和渗透侵袭能力。以Transwell小室模型和基质胶小室模型模拟体外肿瘤细胞的生存环境进行体外迁移和侵袭能力的检测,实验结果显示胶质瘤细胞内MICAL-L2的表达上调可明显促进其体外迁移和渗透侵袭能力。7.MICAL-L2可调节胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移活动相关蛋白的表达水平。对生物体内细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移这些生命活动所涉及的相关蛋白进行WB实验检测,发现PCNA、Bcl-2、Cyclin D1、FAK、ICAM1、MMP2和MMP9在进行MICAL-L2干扰敲减后的蛋白表达量明显降低;而Bax和Cleaved-caspase-3的表达量较之阴性对照组则明显增高。8.MICAL-L2可影响胶质瘤细胞的EMT进程为了揭示MICAL-L2和EMT在胶质瘤中的关系,我们以WB法检测了EMT进程关键蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达水平。结果显示MICAL-L2与胶质瘤细胞上皮特征的减少和间充质性状的增加密切相关。9.MICAL-L2可激活胶质瘤细胞中的PI3K/AKT信号通路。KEGG信号通路分析提示差异表达的MICAL-L2与PI3K/AKT信号通路的激活密切相关。Western blot实验对PI3K/AKT信号通路相关蛋白进行分析,结果提示磷酸化的PI3K和AKT,以及PI3K/AKT信号通路下游的磷酸化m TOR和GSK3β,这些蛋白的表达水平在MICAL-L2敲减细胞模型中较之对照组均明显降低。10.MICAL-L2和EGFR蛋白水平的表达之间存在正相关性通过q PCR实验和Western blot实验对EGFR分别进行mRNA和蛋白水平的检测,结果显示随着胶质瘤细胞中MICAL-L2的降低,EGFR的蛋白表达递减,而其mRNA的丰度并没有很大变化。11.EGFR抑制剂能抑制MICAL-L2过表达所导致的PI3K/AKT信号通路的激活。以EGFR抑制剂过表达MICAL-L2的U87和PGC24细胞株和相应对照组进行处理后,检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。结果显示MICAL-L2可通过EGFR的介导调节PI3K/AKT信号通路的激活程度。12.EGFR抑制剂能回复MICAL-L2过表达所导致的胶质瘤细胞体外恶性生物学行为的变化,阻止胶质瘤细胞发生EMT转化。EGFR抑制剂两组过表达细胞模型进行处理后,用MTS法、EDU成像和克隆形成实验检测过表达MICAL-L2细胞株的增殖能力,Tunel法进行凋亡检测,体外小室模型进行细胞迁移和侵袭能力观测。实验数据提示MICAL-L2确实可通过EGFR传递相关调节信号参与胶质瘤细胞体外恶性生物学效应的调控并影响其间充质转化。结论:在这项研究中,我们通过生物大数据分析从细胞骨架调控蛋白家族MICALs中筛选出具有稳定临床预后价值和研究价值的基因的MICAL-L2。并在临床标本中证实了MICAL-L2的显着上调与胶质瘤的病理级别和组织学亚型相关。胶质瘤中MICAL-L2的异常激活可影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭活动,并参与到细胞的上皮-间质转化进程。此外,我们的发现揭示了细胞骨架蛋白MICAL-L2与内源性表皮生长因子受体EGFR以及PI3K/AKT信号通路之间的关系,证实胶质瘤细胞中MICAL-L2可通过EGFR维持PI3K/AKT信号通路的活性,从而对胶质瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭行为进行调控,影响胶质瘤细胞的恶性转化进展。