热带泰勒虫病(Tropical theileriasis)是由环形泰勒虫(Theileria annulata)感染引起的蜱传性血液原虫病,患病动物通常表现出体表淋巴结肿大、高热、贫血、消瘦等临床症状。环形泰勒虫裂殖体感染的宿主单核/巨噬细胞、树突状细胞及B淋巴细胞在体外培养时能够无限增殖,表现出癌细胞的生长特性,即转化特性;当感染细胞用抗寄生虫药物布帕伐醌(Buparvaquone,BW720c)处理后,宿主细胞恢复正常细胞的生长及凋亡特性。参考环形泰勒虫基因组、蛋白组数据,同时结合相关文献,本研究选取可能参与细胞转化的环形泰勒虫裂殖体膜蛋白或分泌蛋白,利用酵母双杂交技术,筛选与其相互作用的宿主细胞蛋白。对环形泰勒虫裂殖体感染的细胞系TaNM1细胞进行siRNA干扰及药物处理后,检测信号通路关键分子基因的表达及蛋白磷酸化水平,从而了解互作蛋白分子对宿主细胞信号通路的影响,为阐明环形泰勒虫调节宿主细胞转化的分子机制奠定基础。主要研究结果如下:1.成功构建环形泰勒虫的7个转化相关基因TaSP、SVSP2、EMM、Glu、CP、URP及Cyp1的pET30a原核表达载体,经诱导表达后,纯化获得浓度在0.3 mg/mL左右单一条带的重组蛋白。用纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔,获得这7种蛋白的兔源多克隆抗体。亚细胞定位结果表明Cyp1、Glu及URP内源性蛋白主要分布在裂殖体内部,表面也有少许分布,而SVSP2主要分布在裂殖体细胞核附近;EMM及CP主要分布在裂殖体周围。这些蛋白的分布表明它们可能通过与宿主细胞蛋白分子的相互作用进而调节细胞转化。2通免疫磁珠分选方法,从健康牛的PBMCs中分离出高纯度的B淋巴细胞,经流式细胞仪鉴定纯度为95.3%;构建牛B淋巴细胞cDNA文库,文库鉴定结果显示:读码框1、2和3的初级文库容量分别大于2.6×10~6 cfu、1.1×10~6 cfu及2.0×10~6 cfu,文库扩增基数大于150万cfu,其中读码框1、2和3中插入片段大小,分别为1000?3500 bp、750?2250 bp及600?3500 bp,表明构建的B淋巴细胞文库具有较高的质量,可用于转化相关分子与宿主细胞相互作用分子的筛选。同时成功构建这7种转化相关基因的pGBKT7重组诱饵质粒,并对这7个诱饵质粒进行酵母的自激活性与毒性试验,结果表明所有诱饵质粒均无自激活性与毒性,可作为诱饵质粒用于双杂交筛选。3.通过对环形泰勒虫CP及Cyp1的功能结构域预测及SWISS-Model同源建模,成功构建TaCP及TaCyp1高级结构模型,并显示出结构域与蛋白二级结构的分布关系,为蛋白相互作用位点的预测提供依据。此外酵母蛋白的western blot结果表明CP及Cyp1在酵母细胞中获得正确表达。通过酵母双杂交筛选,首次证明宿主细胞分子CRBN和Ppp4C与CP之间存在相互作用,MED21及SEC31A与Cyp1之间存在相互作用,这为研究CP及Cyp1与宿主细胞之间的相互作用提供了有效靶分子。4.通过GST-pull down进一步验证MED21与Cyp1之间的相互作用。TaNM1细胞的MED21干扰及BW720c药物处理实验结果表明:药物处理后细胞中IκBα及IκBβ的磷酸化水平明显降低,表明NF-κB信号通路活性降低;MED21基因被干扰后,核转录因子NF-κB1及NF-κB2的基因表达量明显下降,但P105及P52蛋白表达量无明显变化,至于其分子机制还需进一步研究。