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实验目的:肺癌与大肠癌是常见的恶性肿瘤。据统计,在世界范围内肿瘤性疾病中,肺癌与大肠癌发病率及死亡率分别排在第一位及第三位,严重威胁人类健康。随着对肿瘤发生的分子机制的研究,寻找有效的分子生物学标志物对肿瘤高危人群开展早期筛选,对于降低肺癌及大肠癌的发生率及死亡率,改善患者的生活质量有着重要意义。本课题组前期通过对肿瘤发生过程中异常甲基化改变进行全基因组筛选,发现ANKRD18B基因(Ankyrin repeat domain 18B)在肺癌及大肠癌发生过程中明显高甲基化,提示该基因异常甲基化可能与肺癌及大肠癌发生有关。同时,通过文献检索,未发现该基因异常甲基化和表达调控等在肺癌及大肠癌中的相关报道,因此具有较大的研究价值。根据前期的实验结果,我们推测ANKRD18B基因在肿瘤发生过程中通过高甲基化而失活,可能是一个候选的抑癌基因,因此有必要进一步扩大样本证实该基因在肺癌及大肠癌中甲基化的变化情况以及与临床病理的关系,同时对该基因在肿瘤发生过程中的作用和功能进行初步研究。为进一步研究该基因在生长发育、疾病发生、信号通路等方面的作用提供理论基础。实验方法:1.采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)方法分析肺癌组织及正常组织、肺癌患者血浆及痰液中ANKRD18B基因高甲基化的发生情况;对临床资料完整的配对大肠癌患者癌组织及癌旁正常组织采用MSP方法分析ANKRD18B基因甲基化的变化情况;2.利用MSP方法,分析了来源于不同组织肿瘤细胞株和正常细胞中ANKRD18B基因甲基化情况;3.采用RT-PCR对去甲基化药物5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-dC)处理前后的肿瘤细胞中ANKRD18B基因的表达情况进行分析,评价ANKRD18B基因甲基化对其表达调控的影响;4.构建ANKRD18B基因高表达细胞模型,采用细胞克隆形成实验等方法,对该基因在肿瘤发生过程中的功能进行初步研究。实验结果:1.采用msp方法分析了ankrd18b基因在98例肺癌组织和20例正常组织中的高甲基化发生情况。结果发现:53.1%(52/98)肿瘤组织中该基因高甲基化,而20例正常组织中均未检测到该基因高甲基化(0%,0/20)(p<0.01)。2.应用msp方法分析了来源于肺癌病人的65例痰液标本和85例血浆标本中ankrd18b基因甲基化发生情况。结果发现:36.9%(24/65)血浆标本和38.8%(33/85)的痰标本中能够检测出该基因的高甲基化。3.对病理资料完整的62例肺癌组织ankrd18b基因甲基化与临床病理关系进行分析发现:该基因甲基化与年龄、性别以及肿瘤类型等没有明显的相关性(p>0.05);但在吸烟病人肿瘤组织和早期肿瘤组织中该基因甲基化有一定增加,而且肿瘤细胞分化程度越低,该基因甲基化发生率越高(p=0.009)。4.对41例大肠癌组织及20例对应癌旁正常组织采用甲基化特异性pcr(msp)法进行了ankrd18b基因甲基化分析,结果发现:在20例癌旁正常组织中ankrd18b基因均未发生甲基化(0%,0/20),而在41例大肠癌组织中,该基因甲基化发生率为59%(24/41)(p<0.01)。5.在肺癌细胞株a549、spc-a-1、95d、h1975、h358、h1650、ltep、h1395、h446和h460中高甲基化分析表明,ankrd18b甲基化发生率为90%(9/10),仅有h1650中未发生甲基化情况,而在正常hbe细胞中未检测到该基因高甲基化发生。同时在大肠癌ht-29和sw480细胞中该基因也发生了高甲基化。6.在不同肺癌细胞株中采用rt-pcr及荧光定量pcr方法检测该基因甲基化与其表达调控的关系。结果表明:该基因高甲基化的肺癌细胞中其表达明显下调,而正常支气管上皮细胞hbe表达较高。为了进一步证实该基因表达下调是由于其高甲基化导致的,对部分细胞采用去甲基化药物5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-dc)去甲基化处理,结果发现ankrd18b基因高甲基化细胞经去甲基化处理后,其表达明显上调,表明该基因甲基化直接调控其表达。由于该基因在肿瘤发生中明显高甲基化失活,提示其可能是一个候选的抑癌基因。7.以h358细胞为基础,成功建立了该基因高表达细胞模型。通过细胞克隆形成实验分析,发现该基因高表达后,能够明显抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤细胞克隆形成。实验初步证明ankrd18b基因具有抑癌作用。结论:1.ANKRD18B基因在肺癌组织、大肠癌组织、不同肿瘤细胞株中均明显表现高甲基化,其甲基化发生率与肿瘤的发生有关,是肺癌及大肠癌早期诊断的候选标志物。2.ANKRD18B基因甲基化能调控该基因的表达,且甲基化程度与表达呈负相关关系。3.ANKRD18B基因可抑制肿瘤生长,是一个潜在的抑癌基因。