背景和目的食管癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率均较高,严重威胁了人类的生命健康。我国是食管癌发病率最高的国家之一,其中河南尤为高发,组织学类型以鳞状细胞癌为主。大量文献资料已经证实与食管癌发病相关的因素有很多,但食管癌的发生发展机制尚不清楚,临床大多数患者的治疗效果不好,预后差。因此,对食管癌的发生发展机制进行更深入的探讨成为目前研究的重点和难点。能量代谢是肿瘤发生的关键因素,近年来研究发现有氧糖酵解是大多数肿瘤细胞的主要代谢方式,与肿瘤的发生发展密切相关。M2型丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase M2,PKM2)是糖酵解途径中关键的限速酶,其在肿瘤的能量代谢过程中发挥了重要作用。我们在前期研究中通过免疫组织化学检测证实,PKM2在食管鳞癌组织中高表达,可能与其发生发展有关。PKM2在体内的功能及活性受到多种因素的调节,干扰素刺激基因15(Interferon-stimulated gene15,ISG15)参与的类泛素化修饰也是其主要调控途径之一。泛素特异性蛋白酶18(Ubiquitin specific protease 18,USP18)是ISG15的特异性解聚酶,主要通过去类泛素化作用参与蛋白质的功能调节。近年来研究发现USP18也可以通过调控干扰素的产生及细胞增值等途径影响肿瘤的发生。我们的前期实验结果显示USP18在食管鳞癌组织中的表达升高,且与食管鳞癌的发生有关,由此引发了后续的研究。ISG15是第一个被鉴定的类泛素蛋白(Ubiquitin-like protein,UBL),和泛素相似,它可以对多种目标蛋白质进行共价修饰,参与多个信号通路的调节,对机体的天然免疫反应非常重要。近年来研究发现,类泛素修饰酶系的功能紊乱可以导致肿瘤的发生,在多种肿瘤细胞中ISG15的表达水平明显升高,并且与肿瘤细胞的增值、侵袭和转移有关。然而,关于ISG15蛋白在食管鳞癌组织中的表达情况及其与食管鳞癌的发生发展及PKM2、USP18的相关性,目前尚未见相关文献报道。本研究采用免疫组织化学和Western Blot方法分别检测ISG15蛋白在食管鳞状细胞癌组织和细胞株中的表达水平,探讨ISG15在食管鳞状细胞癌的发生发展中的意义,并分析ISG15、USP18和PKM2的表达在食管鳞状细胞癌组织中的相关性。为进一步探讨ISG15在肿瘤中的作用及食管癌的发生发展机制提供理论基础。方法1.收集食管鳞状细胞癌组织70例、食管鳞状上皮内瘤变组织60例及正常食管粘膜组织30例,制成组织切片备用;培养食管鳞状细胞癌细胞株KYSE70及正常食管粘膜上皮细胞株HET-1A,提取细胞蛋白。2.采用免疫组织化学SP-9000三步法检测ISG15蛋白在食管鳞状细胞癌、食管鳞状上皮内瘤变及正常食管粘膜组织中的定位及表达情况。通过Western Blot方法检测HET-1A和KYSE70两种食管细胞株中ISG15蛋白的表达水平。3.统计学分析:采用SPSS 21软件进行数据分析与处理,计数资料采用t检验分析,结果以均数±标准差表示;分类资料采用χ~2检验分析;相关性分析采用Spearman等级相关分析。检验水准(双侧)α=0.05。结果1.免疫组化结果显示:ISG15在食管鳞状细胞癌、食管鳞状上皮内瘤变及正常食管粘膜组织中的阳性表达率分别为74.3%、33.3%、6.7%,3组间的差异显著,具有统计学意义(χ~2=45.1,P<0.05),然后分别进行两两比较,组间差异均有统计学意义。在食管鳞状上皮内瘤变组中,高级别鳞状上皮内瘤变组的ISG15阳性表达率(46.7%)明显高于低级别鳞状上皮内瘤变组(20%),差异具有统计学意义(χ~2=4.8,P<0.05)。对相关临床病理参数的分析显示,ISG15的表达水平在不同性别、年龄、肿物大小、分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移组别间的差异均无统计学意义(P>0.05)。相关性分析表明,食管鳞状细胞癌组织中ISG15和PKM2的表达呈正相关(r=0.672,P<0.05),而ISG15和USP18以及PKM2和USP18的表达均无相关性(P>0.05)。2.Western Blot结果显示:HET-1A细胞株中ISG15蛋白的表达水平为0.23±0.07,KYSE70细胞株中ISG15蛋白的表达水平为1.20±0.34,食管鳞状细胞癌细胞株中ISG15的表达水平明显高于其在正常食管粘膜上皮细胞中的表达水平,差异具有统计学意义(t=8.04,P<0.05)。结论1.ISG15蛋白在食管鳞状细胞癌中高表达,提示ISG15可能与食管鳞状细胞癌的发生有关。2.PKM2蛋白和ISG15蛋白在食管鳞状细胞癌的发生中可能存在协同作用,共同促进肿瘤的发生。