研究背景和目的整形修复美容外科在临床面临的最常见问题是因肿瘤切除术后、先天性畸形及外伤等各种原因所造成的软组织缺损的修复和求美者因美容需求的软组织填充。为了解决上述难题,真皮移植、人工合成材料、胶原注射剂以及游离脂肪组织移植等都被越来越多地被应用于临床工作中。自体脂肪组织被认为是理论上最理想的软组织填充材料来源。自Neuber于1893年率先采用自体脂肪移植治疗软组织缺损至今已有一百多年历史,但脂肪组织移植目前存在吸收率高达30～50%等难于解决的问题,限制了其在临床的广泛应用。因此,如何在体内实现对脂肪组织存活机制的调控,达到理想的填充效果,是整形外科临床应用及理论基础研究中的一个重大难题。关于游离移植脂肪的存活机制,学术界存在两种观点：一种是宿主取代论,即脂肪移植后宿主的巨噬细胞将吞噬坏死脂肪细胞释放的脂滴,变为成熟脂肪细胞,继而取代原有的移植细胞,其核心内容在于它认为来自宿主的巨噬细胞在移植后存活过程中起着最关键的作用；另一种为细胞存活论,即宿主巨噬细胞的作用仅限于清除坏死脂肪细胞所释放的脂滴,但是并不能转变成脂肪细胞来取代移植的脂肪组织,供体的脂肪细胞在度过最初的缺血缺氧期等极端环境后,可以长期存活下来。归根到底,这两种观点最终争论的关键在于--成熟脂肪细胞是否能耐受移植早期缺血缺氧的环境并存活?众所周知,成熟脂肪细胞这种占脂肪组织全部细胞数不到六分之一的细胞调控着脂肪组织的主要功能--脂质代谢。一直以来,我们对脂肪细胞了解都比较少,认为其不但是一种处于终末分化状态且分化过程不可逆的细胞,并且其极其脆弱,离体后存活不超过24小时。直至上世纪七十年代,Van在体外培养过程中才发现,成熟脂肪细胞可以脱去脂质变成对缺血缺氧更为耐受的成纤维细胞样形态,被称为“去分化脂肪细胞”,而且去分化脂肪细胞在合适的条件下可以再分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞。不仅如此,去分化脂肪细胞移植后可以促进尿道括约肌的再生,还可以分化为心肌样细胞修复缺血心肌,甚至自发形成内皮细胞。后来有学者使用微阵列系统,通过基因表达分析证实了脂肪细胞在体外去分化过程中有关细胞功能表型基因的下调和有关细胞增殖、分化方面基因的上调。我们知道,体内环境错综复杂,去分化现象通常和肿瘤发生息息相关,但有学者发现一些哺乳动物的体细胞,如施旺细胞、心肌细胞、生殖细胞等,在某些特定的信号和刺激因子单独或共同作用下,比如当局部组织发生急慢性损伤时,其可以获得去分化的能力,回复到干细胞或者是干细胞样细胞状态,并参与了一系列简单或复杂的生物学过程。那么体内环境中的脂肪细胞在生理或病理环境下(例如移植早期),是否能够像体外及其他成体细胞一样发生去分化进而适应极端的环境?对于这个问题的解答,将有助于我们更好地理解游离脂肪移植后的存活机制,在移植早期,促进脂肪细胞的去分化,中晚期,加强细胞的再分化,势必将提高组织存活率,减少吸收率,为软组织缺损的修复建立一种微创、安全且稳定有效的治疗途径。围绕这个科学问题,本实验拟通过扩张器在体内构建一种缺血缺氧并充满压力的极端环境,接着通过HE、免疫组化、透射电镜观察,PCR分析处于这种环境下脂肪组织中的脂肪细胞会发生的变化,以及当环境恢复正常时脂肪细胞转归情况。然后为了进一步排除脂肪组织中其他细胞对实验观察分析的干扰,使用分离纯化技术和注射的方式将带荧光标记的脂肪细胞移植入体内,通过活体荧光成像及全组织染色技术来动态观察其变化情况。方法1、扩张器辅助构建脂肪细胞体内去分化模型及去分化现象的相关检测通过整形外科常见皮肤软组织扩张技术将扩张器置于SD大鼠腹股沟脂肪垫下,定期注水扩张,不同时间点取材。然后对各个时间点样本进行诸如大体观察、HE染色观察、透射电镜超微结构观察、免疫组化染色分析和Real-time PCR分析。随后取出扩张器,一定时间后再次对脂肪组织进行大体观察、HE染色观察和Real-time PCR分析。2、定点靶向荧光监测脂肪细胞移植后转归利用绿色荧光蛋白转基因小鼠,将其腹股沟脂肪垫进行分离纯化后得到脂肪细胞,通过游离脂肪移植技术将纯化的脂肪细胞注射进普通小鼠体内。活体荧光观察不同时间点观察荧光强弱来评估移植脂肪细胞的存活情况,全组织染色检测移植后各个时间点脂肪细胞的形态变化。3、统计学处理数据以均数±标准差(x±s)形式表示,使用统计软件SPSS13.0进行数据处理。Real-time PCR结果不同时间点的差异采用单因素的方差分析。关于分离的脂肪细胞的细胞核的数目采用卡方检验分析。P值小于0.05说明具有统计学意义。结果1、扩张后脂肪垫较对侧正常脂肪垫明显变薄,质地变韧,颜色较暗,且有较多血管攀附。其与扩张器接触面形成一致密包膜,不易剥离。脂肪垫最薄的部位几乎透明,此处为扩张器顶点位置,也是血流量最小的部位。取出扩张器两周后扩张脂肪垫质地变软,颜色与对侧正常脂肪趋于一致,原最薄部位出现一些白色组织,类似正常脂肪。2、组织学观察及超微结构观察显示随着时间推移,注水量增加,压迫脂肪组织中的单房的成熟脂肪细胞会逐渐脱去脂滴,向多房脂滴甚至不含脂滴细胞状态转化。同时脂肪组织中具有增殖能力的细胞会增加,并且这些细胞来源于脂肪细胞。当扩张器撤去后,脂肪组织中可见大量新生的脂肪细胞。3、实验结果显示单个脂肪细胞植入体内后可以存活,但随着时间推移,数目逐渐减少。第1天可见大部分存活良好的脂肪细胞,第7天可见存活的脂肪细胞减少,其中发现一些多房脂肪细胞。第21天时,极少数脂肪细胞存活,并发现极少数长梭形的细胞。讨论一直以来,脂肪细胞都被认为是一种缺乏变化,脆弱的分化终末期细胞。所以,针对移植脂肪组织中央区存活的脂肪细胞来源,大部分研究都集中在脂肪间质细胞,例如：脂肪来源干细胞、前脂肪细胞等,认为该类细胞可成脂分化,新生为脂肪细胞,提高移植物的存活率；却鲜有人关注脂肪细胞自身在恶劣环境下的变化及存活能力。近年来,研究者发现体外缺氧培养环境下,成熟脂肪细胞发生了形态改变,从单房圆形指环状逐渐丢失胞质中的脂质,变为成纤维细胞的形态,我们把这种生理学上的变化叫做“脂肪细胞去分化”。成熟的脂肪细胞内的油滴由甘油三酯和胆固醇酯形成脂核,表面包被多种蛋白质分子而形成。蛋白参与脂滴的生成、融合、转运、存储和脂肪分解代谢的分子调控过程。胞内油滴被认为是一种具有代谢功能的亚细胞器,随着机体进食或饥饿等能量变化,出现脂肪生成和脂肪分解的双向过程,达到机体的动态平衡。脂肪细胞去分化即是将油滴分解排出胞体外的过程。去分化能力也是机体进化过程中所获得的一种自身保护性机制。相对脂肪细胞,去分化脂肪细胞被认为具有更强大的耐受缺血缺氧的能力。本实验中,随着时间的推移,注水量的逐渐增多导致脂肪垫缺血缺氧情况愈发严重,虽然没有直接动态观测到脂滴的分解与排出,但处于极端环境中的脂肪细胞发生了形态学与基因表达学的巨大改变,这些改变让脂肪细胞更为适应恶劣的环境。去分化是发育生物学和形态学领域一个古老又常新的现象,随着去分化的发生,处于终末分化的细胞会退回到一种低分化的状态,并且同时获得了增殖与再分化的能力,这被认为是组织再生重要的机制之一。组织再生的最终目的是产生额外的细胞来代替损伤或丢失的细胞,作为一个动态平衡的组织,脂肪组织每年大概更新10%左右的脂肪细胞。传统观念认为,再生的脂肪细胞来源于脂肪组织中基质干细胞以及循环中的骨髓造血系细胞,但有学者提出去分化的脂肪细胞及其后代也是这些再生脂肪细胞的重要来源。诸多体外实验证实了这种可能性的存在,但体内脂肪细胞是否存在去分化仍然不清楚。我们的实验显示了单房脂肪细胞在体内极端环境下可以退回到多房脂肪细胞甚至不含脂滴的长梭形细胞形态,同时成脂相关基因表达下降,并获得了增殖及再分化的能力。这些都是脂肪细胞体内去分化的重要证据。去分化脂肪细胞具有重要的应用前景,其来源丰富,供区损伤小,不含杂质细胞,并且具有多项分化潜能,这些特性使之成为再生医学领域的一颗新星。然而,脂肪细胞的去分化过程需进行一段时间的体外操作过程,体外培养中的不可预知性成为其应用于临床最大的制肘。我们的研究证实了脂肪细胞体内去分化现象的存在,接下来我们将进一步探究其机制,进而体内调控脂肪细胞,进行一些预处理使之去分化后发挥其最大效能,这将为我们在再生医学和组织工程领域的研究提供一些新的思路。结论1、本文利用扩张器扩张压迫作用使脂肪组织处于一种机械力和缺血缺氧的极端环境,在这种环境下脂肪组织中正常的单房脂肪细胞会减少,它们通过脱去脂质而改变细胞形态,并且脂肪细胞减少的同时具有增殖能力的细胞会增多,而这些增殖细胞是脂源性的。当周围环境恢复正常时,我们可以见到许多新生的脂肪细胞。此实验证实脂肪细胞在体内也可发生去分化与再分化,其在国内外尚未见明确报导,这可能是游离脂肪移植后存活的机制之一。2、通常认为脂肪细胞在体内缺氧缺血环境难以存活,我们证实了脂肪细胞移植进入体内后其实可以存活,但随着时间的推移,细胞存活量会逐渐减少。最后存活下来的脂肪细胞发生了诸如体外脂肪细胞去分化实验的变化,形态从单房脂肪细胞到多房脂肪细胞最后变成不含脂滴的长梭形细胞。该研究更直观地显示了单个脂肪细胞在体内发生的去分化形态改变,是对前部分实验的补充与对游离脂肪移植后存活的机制更直接的阐述。