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目的：通过观察外源性转化生长因子β3（TGF-β3）对大鼠肝星状细胞（HSC）中TGF-β3启动子活性和磷酸化cAMP反应元件结合蛋白-1（CREB-1）的影响，研究TGF-β3自反馈调节信号通路中正向调节因子。方法：（1）构建并检测TGF-β3启动子和CRE位点突变的TGF-β3启动子荧光素酶报告基因质粒（PGL3-TGFβ3-P和PGL3-TGFβ3-MP），并判断脂质体转染法对细胞形态的影响；（2）用外源性TGF-β3诱导大鼠HSC细胞，2h后提取总RNA，通过实时荧光定量PCR法测定对照组和实验组中TGF-β3mRNA的表达情况；（3）用外源性TGF-β3诱导转染了PGL3-TGFβ3-P的大鼠HSC细胞，于不同时间点，用荧光素酶报告基因分析法检测TGF-β3启动子活性；（4）将TGF-β3启动子上的CRE结合位点基因突变，并将该突变的报告质粒与正常质粒一起转染与大鼠HSC细胞，加/不加TGF-β3进行诱导，通过荧光素酶报告基因分析法检测启动子的活性；（5）用外源性TGF-β3诱导大鼠HSC细胞，于不同时间点提取核蛋白，通过电泳迁移率分析法（EMSA）检测各时间点磷酸化CREB-1的DNA结合活性，同时采用western-blot方法检测磷酸化CREB-1各时间点的变化情况；（6）用外源性TGF-β3诱导大鼠HSC细胞，于不同时间点分别提取细胞总RNA和核蛋白，用western-bloting法检测CREB-1的表达情况以及实时荧光定量PCR检测CREB-1mRNA的表达情况。结果（1）电泳结果显示成功构建正常和突变的TGF-β3启动子报告基因质粒，用Lipofectamine2000脂质体转染法对大鼠HSC细胞进行转染后无明显毒性；（2）大鼠HSC细胞被外源性TGFβ3诱导2h后，TGFβ3mRNA的表达明显上升（上升3.7倍，P=0.003）；（3）外源性TGF-β3处理HSC后，TGF-β3启动子活性表现出时间依赖性增高，并于诱导后24h达峰值（2.2倍于对照组，P＜0.05）；（4）CRE位点的缺失显示出TGF-β3启动子对外源性TGF-β3诱导HSC时的不应答，TGF-β3启动子的基础活性下降85%（P＜0.05）；（5）EMSA结果显示，DNA探针有很好的特异性，外源性TGF-β3可诱导磷酸化CREB-1的DNA结合活性持续增强，同时western-blot结果显示外源性TGF-β3可以引起磷酸化CREB-1表达增加；（6）外源性TGF-β3对大鼠HSC中CREB-1mRNA和CREB-1蛋白的表达无影响。结论（1）外源性TGF-β3可促进TGF-β3启动子活性增强，且CRE位点在外源性TGF-β3介导的TGF-β3启动子活性中发挥重要作用；（2）外源性TGF-β3可促进CRE结合蛋白磷酸化CREB-1的DNA活性及表达，但不能促进CREB-1蛋白及mRNA的表达。本研究显示TGF-β3可自身活化，CREB-1的磷酸化在该信号通路中发挥重要作用。目的：通过研究外源性TGF-β3对HSC中TGF-β1/smad信号通路的影响，探讨TGF-β3抗肝纤维化机制。方法：（1）用外源性TGF-β3（10ng/ml）处理/不处理HSC细胞，2h后提取细胞总RNA，通过实时荧光定量PCR测定TGF-β1/smad信号通路中各因子的mRNA表达情况；（2）用外源性TGF-β3（10ng/ml）处理HSC细胞，于不同时间点收集细胞总RNA和总蛋白，通过实时荧光定量PCR和western-blot测定smad7的表达情况；（3）将具有最佳抑制率的smad3siRNA干扰片段和空白质粒通过Lipofectamine2000脂质转染法导入HSC细胞中，24h后，加/不加外源性TGF-β3（10ng/ml）处理HSC细胞，2h后收集细胞总RNA，通过实时荧光定量PCR测定smad7mRNA的表达情况；（4）将具有最佳抑制率的CREB-1shRNA干扰质粒、pSRV-CREB-1表达质粒和空白质粒通过Lipofectamine2000脂质转染法导入HSC细胞中，24h后，加/不加外源性TGF-β3（10ng/ml）处理HSC细胞，2h后收集细胞总RNA，通过实时荧光定量PCR测定smad7mRNA的表达情况；（5）将CREB-1shRNA干扰质粒、pSRV-CREB-1表达质粒和空白质粒导入HSC细胞中，24h后，加/不加外源性TGF-β1（10ng/ml）处理HSC细胞，2h后收集细胞总RNA，通过实时荧光定量PCR测定smad7mRNA的表达情况；（6）将HSC细胞用ERK抑制剂（20mM)、JNK抑制剂（20mM）、p38抑制剂（20mM）和PKA抑制剂（5mM）预处理30分钟，然后加/不加外源性TGF-β3（10ng/ml）,2h后收集细胞总RNA，通过实时荧光定量PCR测定smad7mRNA的表达情况。结果：（1）在HSC中，外源性TGF-β3可诱导smad6低表达（1.5倍于对照组）和smad7高表达（3.6倍于对照组），其差异具有统计学意义（P≤0.001）,但外源性TGF-β3对TGF-β/smad信号通路中的其他因子均无影响；（2）外源性TGF-β3可在短时间诱导HSC中smad7的大量表达，1hmRNA达到顶峰(4.1倍于对照组），2h蛋白达到最高，随后这一诱导作用逐渐下降，但24h其差异具有统计学意义（P<0.05）；（3）在HSC中， smad3的降低可显著抑制基础状态（非外源性TGF-β3诱导）smad7的表达，同时也可阻断外源性TGF-β3对smad7的诱导作用，与空白质粒对照组相比，其下降50%，有显著统计学意义（P<0.05）；（4）在HSC中，降低或过表达CREB-1蛋白均不能影响正常状态下smad mRNA的表达，然而降低CREB-1可显著抑制外源性TGF-β3对smad7的诱导作用，与空白质粒对照组相比，其下降42%，有显著统计学意义（P<0.05），过表达的CREB-1也可加强外源性TGF-β3对smad7的诱导作用，与空白质粒对照组相比其差异有统计学意义（P<0.05）；（5）经过激酶抑制剂的预处理后，外源性TGF-β3对smad7的诱导作用明显受到p38抑制剂的影响，与阳性对照组相比下降40%（2.64±0.37），其差异有统计学意义（P<0.05），然而各激酶抑制剂不影响基础状态下smad7mRNA的表达，ERK抑制剂、JNK抑制剂和PKA抑制剂均不能影响外源性TGF-β3对smad7的诱导。（6）在HSC中，外源性TGF-β1可诱导smad7mRNA的表达（1.5倍于对照组，P<0.05），然而抑制或过表达CREB-1均不能影响外源性TGF-β1对smad7的诱导作用，与阳性对照组相比，其差异没有统计学意义（P>0.05）。结论：(1) TGF-β3促进HSC中smad7的表达；（2）smad3是调控smad7的关键转录蛋白；（3）TGF-β3通过p38活化CREB-1，后者入核参与调节smad7的表达。因此，TGF-β3可能通过活化CREB-1辅助smad3稳定调节HSC中smad7的表达，提示CREB-1可能是一个十分重要的抗肝纤维化蛋白。