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【背景和目的】2型糖尿病是一种代谢疾病,由胰岛素抵抗和β细胞功能障碍共同作用引起。探讨β细胞损伤在糖尿病进展中的作用对于阐明糖尿病的发病机制至关重要。据报道,蛋白的O-GlcNAc修饰（O-GlcNAcylation）与β细胞损伤以及2型糖尿病的发生发展密切相关。O-GlcNAc修饰是一种蛋白质翻译后修饰方式,由O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase,OGT）和O-GlcNAc水解酶（O-GlcNAcase,OGA）动态调控,其中OGT负责将UDP-GlcNAc引入到蛋白质的Ser和Thr位点上,而OGA负责将蛋白上的O-GlcNAc糖链水解下来。蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰可通过感受己糖胺生物合成途径（HBP）通量来发挥营养感受器的功能,葡萄糖代谢可促进O-GlcNAc修饰底物UDP-GlcNAc的含量,促进蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰的发生。既往研究表明,OGT的缺失会导致β细胞衰竭和糖尿病的发生,然而过表达OGT未能改善β细胞功能紊乱及糖代谢损伤。尽管关于OGT对β细胞的作用有广泛的研究,但目前对于OGA在胰岛β细胞中发挥的作用尚不完全清楚。因此,本研究通过构建普通饮食和高糖饮水（HGD）β细胞OGA敲除小鼠模型以及OGA敲减细胞系,来探究OGA缺失对小鼠β细胞功能和糖代谢的作用及机制。【研究方法】1.胰岛β细胞OGA敲除小鼠的构建与验证课题组前期使用基因打靶技术和Cre-Lox P系统成功构建了Ins2-Cre小鼠。接着通过鼠尾基因型鉴定和免疫组织化学染色（IHC）的方法对OGA-βKO小鼠进行筛选和验证。2.小鼠糖代谢表型检测通过血糖及体重监控、腹腔注射葡萄糖耐量实验、悬液芯片多重因子检测以及胰腺组织Tunel染色的方法,探究无诱导条件下β细胞OGA敲减对小鼠糖代谢的影响。接着我们对小鼠使用高糖饮水（HGD）造模,并通过血糖及体重监控、腹腔注射葡萄糖耐量、腹腔注射胰岛素耐量、小鼠脂肪称量以及体脂率检测的方法,进一步探究在代谢压力下β细胞OGA敲除对小鼠糖代谢的影响。3.OGA-βKO小鼠能量代谢的检测本研究使用了美国Columbus仪器公司生产的综合实验室动物监测系统（CLAMS）,实时监测小鼠在不同时间段（Light、Dark）以及不同处理（Fed、Fasted）条件下的氧气消耗量（VO2）、二氧化碳释放量（VCO2）、呼吸商（RER）以及产热（Heat）,来评估胰岛β细胞OGA缺失对小鼠能量代谢的影响。4.OGA敲除β细胞系的构建及功能验证使用si RNA技术构建OGA敲减β细胞系,并通过Q-PCR技术对OGA敲减β细胞系胰岛素及胰岛素转录因子（PDX-1、Maf A、Neuro D1）的m RNA水平进行检测,验证OGA缺失对β细胞功能的影响。5.DRP1蛋白的表达检测根据文献报道,推测OGA缺失导致的β细胞损伤可能与DRP1介导的线粒体动力学紊乱相关,因此我们利用Western Blot探究OGA的缺失对β细胞DRP1蛋白表达的影响,并初步探讨OGA通过调控DRP1介导的线粒体动力学紊乱对胰岛β细胞功能的影响。【研究结果】1.成功构建并筛选出OGA-βKO小鼠;OGA-βKO小鼠体重偏低（P＜0.05）;OGA-βKO小鼠空腹血糖和随机血糖无显著差异;OGA-βKO小鼠葡萄糖耐量显著受损（P＜0.05）,而雌鼠糖耐量受损更严重;OGA-βKO小鼠血清胰岛素降低（P＜0.01）,而血清胰岛素多肽、瘦素和抵抗素含量升高（P＜0.05）;TUNEL染色结果显示OGA-βKO小鼠胰岛细胞凋亡增加。2.在高糖饮水造模下,OGA-βKO小鼠血糖无差异,但OGA-βKO雌鼠和雄鼠体脂率升高（P＜0.001）。中老年时,OGA-βKO雌鼠体重偏高（P＜0.05）,O2消耗、CO2释放量、RER和产热（P＜0.001）降低,外周脂肪含量升高（P＜0.001）,OGA-βKO雌鼠糖耐量受损程度更严重（P＜0.0001）;而高糖饮水OGA-βKO雄鼠体重、血糖、O2消耗、CO2释放量、RER、产热以及各外周脂肪含量无显著差异。另外,在45周龄时该雄鼠糖耐量受损,而75周龄时糖耐量恢复,并且在80周龄时出现胰岛素耐量受损（P＜0.05）。3.成功构建并验证MIN6-OGA-KO和INS1-OGA-KO细胞系。MIN6-OGA-KO细胞胰岛素及胰岛素转录因子Neuro D1的m RNA水平表达降低（P＜0.05）,INS1-OGA-KO细胞胰岛素及胰岛素转录因子PDX-1和Neuro D1的m RNA水平表达降低（P＜0.05）,提示OGA的缺失可造成β细胞功能损伤。另外MIN6细胞OGA敲除后,线粒体DRP1表达升高,提示OGA的缺失可促进DRP1向线粒体募集。【结论】1.小鼠胰岛β细胞OGA敲除可通过促进β细胞凋亡,减低β细胞胰岛素的分泌,进而诱导小鼠糖耐量受损,提示OGA缺失可诱导小鼠糖代谢紊乱;另外,与雄鼠相比,普通饮食下β细胞OGA敲除雌鼠糖耐量损伤更显著,提示OGA对维持雌鼠β细胞正常功能和糖代谢稳态更重要。2.在HGD模型下,OGA-βKO雌鼠的体重、糖耐量损伤程度、外周脂肪含量和体脂率更高,其糖代谢损伤更严重,进一步提示OGA介导的O-GlcNAc稳态在雌鼠β细胞和糖代谢调控中发挥更重要的功能。3.体外β细胞OGA缺失可导致胰岛素及胰岛素转录因子PDX-1和Neuro D1m RNA表达水平降低,并促进线粒体动力蛋白DRP1向线粒体募集,推测OGA缺失可能通过DRP1影响线粒体形态,进而影响β细胞功能。