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研究背景动脉粥样硬化的发生是导致心血管类疾病出现的根本原因,是世界排名前十位的死亡原因之一。即使社会经济发展及医疗技术不断革新,动脉粥样硬化的发病率和死亡率始终保持在较高水平。其中颈动脉粥样硬化导致的缺血性脑卒中（占脑卒中发生原因的80%）的致死率常年来稳居各类致死性疾病的前三位。因此寻求动脉粥样硬化发生的机制及治疗的有效靶点仍然当研究热点。颈动脉粥样硬化的发生是一个多因素参与的复杂过程,另有研究表明颈动脉斑块的稳定性在很大程度上影响了脑卒中的发生。目前大量研究表明长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,Lnc RNAs）的异常与心血管疾病直接相关,因而深入探索Lnc RNA与颈动脉斑块稳定性间的调控机制或可开启颈动脉粥样硬化诊治的新篇章。研究目的明确与长链非编码RNA Lnc-C3orf38-2:7相关的共表达凋亡通路相关m RNA;探索两者调控关系并进一步阐明两者协同调控平滑肌细胞凋亡增加进而使颈动脉粥样硬化斑块稳定性下降的具体通路机制。研究方法1.临床样本研究:在患者术前已签署知情同意书并符合伦理审查前提下,采集2018年6月至今在本中心进行颈动脉内膜剥脱手术的颈动脉狭窄患者的病史资料、血液样本及颈动脉斑块组织样本。选取典型颈动脉狭窄稳定及不稳定斑块8对,进行RT-q PCR、PCR电泳及原位杂交等实验,在核酸层面验证前期所筛选的Lnc-C3orf38-2:7共表达凋亡通路相关m RNA:APAF1、JUN、IKBKG和ENDOG的差异性表达。并选取典型颈动脉狭窄稳定及不稳定斑块8对提取蛋白,进行Western Blot实验、免疫组化及免疫荧光等方法在蛋白层面验证Lnc-C3orf38-2:7共表达凋亡通路相关m RNA的下游蛋白在稳定及不稳定斑块组织中的差异性表达。2.体外细胞研究:培育人血管平滑肌细胞,铺板并进行Lnc-C3orf38-2:7慢病毒转染干预,分为“上调组、上调对照组、下调组、下调对照组”四个实验组。进行RT-q PCR、Western Blot实验、流式检测、RNA原位杂交及Ch IRP免疫共沉淀（comprehensive identification of RNA-binding proteins）等实验,探索Lnc-C3orf38-2:7与共表达凋亡通路相关m RNA调控关系并进一步阐明两者协同调控平滑肌细胞凋亡增加进而使颈动脉粥样硬化斑块稳定性下降的具体通路机制。研究结果1.临床样本研究:Lnc-C3orf38-2:7共表达凋亡通路相关m RNAAPAF1经GO分析相关性可能性最大（correlation=0.79,p<0.05）且经后期人体组织样本q RT-q PCR、PCR电泳实验验证与Lnc-C3orf38-2:7存在明确相关性,两者在人颈动脉不稳定斑块中协同上调:RT-q PCR验证m RNAAPAF1在人颈动脉不稳定斑块组中表达量为2.07±0.46,在人颈动脉稳定斑块组中表达量为1.00±0.13,不稳定组中m RNAAPAF1的表达量较稳定组显著上调（p<0.001）;通过灰度分析PCR电泳结果,不稳定组中m RNA APAF1的表达量较稳定组依旧具有显著差异性（p<0.001）。Lnc-C3orf38-2:7共表达凋亡通路相关m RNAAPAF1下游合成的APAF1蛋白是凋亡直接相关蛋白,具有调控多条凋亡途径的作用,是线粒体凋亡途径中的关键促凋亡因子。Western Blot实验、免疫组化及免疫荧光等实验验证其下游凋亡直接相关蛋白APAF1蛋白在不稳定斑块组织的平滑肌细胞中同样表达增加。原位杂交定位Lnc-C3orf38-2:7及共表达m RNA APAF1主要在斑块的平滑肌细胞中表达。预测Lnc-C3orf38-2:7及共表达m RNAAPAF1影响斑块纤维帽中平滑肌细胞的凋亡上调,进而使颈动脉斑块的稳定性降低。2.体外细胞研究:RT-q PCR实验结果显示,相比Lnc-C3orf38-2:7慢病毒干预下调组,m RNAAPAF1在上调组中显著升高,p值小于0.05,具有统计学意义实验经多次重复,结果具有可重复性。使用病毒上调组血管平滑肌细胞进行RNA原位杂交实验,Lnc同时存在于细胞核与细胞浆,主要位于细胞浆;共表达m RNAAPAF1只存在于细胞浆,两者定位高度重合。使用灰度分析分析Westernblot实验结果显示,相比稳定组,APAF1蛋白在上调组中显著升高,且p值小于0.05,具有统计学意义实验经多次重复,结果具有可重复性。流式实验表明APAF1蛋白在病毒干预上调组中的平滑肌细胞膜上表达明显上调。进行CHIP实验进一步明确Lnc直接与m RNA APAF1结合,并翻译表达APAF1蛋白增多,导致纤维帽中平滑肌细胞的凋亡上调,进而使斑块的稳定性降低。研究结论本课题研究通过临床组织样本及体外细胞研究首次对Lnc-C3orf38-2:7、其共表达凋亡通路相关m RNAAPAF1及下游合成的凋亡直接相关蛋白——APAF1蛋白间的具体调控机制进行了探索。明确Lnc-C3orf38-2:7与其共表达凋亡通路相关m RNA APAF1的协同上调关系,并在细胞内定位两者的表达位置关系。提示Lnc-C3orf38-2:7在平滑肌胞浆内通过与凋亡通路相关m RNAAPAF1直接结合的方式,下游合成更多凋亡直接相关蛋白——APAF1蛋白,致平滑肌细胞凋亡上调,进而使斑块纤维帽倾向于破裂,颈动脉斑块组织趋于不稳定,影响了颈动脉粥样硬化疾病的发展进程和最终预后。本研究认为Lnc-C3orf38-2:7及共表达凋亡通路相关m RNAAPAF1可能成为未来颈动脉粥样硬化诊断及治疗新靶点,将为临床诊治颈动脉粥样硬化提供新思路、新策略。