秦皮素对嗜水气单胞菌的抗感染机制研究

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:frjzj
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嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种常见的条件致病菌,能引起淡水鱼类出血、败血、肠炎等疾病。对嗜水气单胞菌病的传统治疗方案以抗生素为主,然而抗生素的不规范使用不仅会造成病原菌耐药性增强,甚至会引起人们对水产品食用安全性的担忧。因此,研究和开发新型抗菌药物成为一项迫切的任务。在水产养殖细菌性疾病的预防和治疗领域,对中草药及其提取物的研究越来越多。秦皮素(fraxetin)别名白蜡树内酯,是中草药秦皮的有效成分,是一种天然的香豆素类化合物,具有抗病原微生物、抗氧化、抗炎以及抗肿瘤等多种药理活性。本研究通过测定秦皮素对嗜水气单胞菌最低抑菌浓度(MIC)、生长曲线以及非抑菌浓度下对其脂肪酶活性、运动能力、蛋白酶活性和溶血能力等毒力相关表型的影响,来探讨秦皮素的体外抑菌机制;采用MTT法测定秦皮素对草鱼肾脏细胞(CIK)的细胞毒性;通过检测秦皮素对团头鲂(Megalobrama amblycephala)感染嗜水气单胞菌后的血液生化指标、抗氧化能力的影响,来分析秦皮素对感染嗜水气单胞菌鱼体的保护机制。主要研究结果如下:1.以含药培养基培养嗜水气单胞菌24 h后,观察到秦皮素浓度为128μg/m L和256μg/m L的培养液澄清透明,表明秦皮素对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度为128μg/m L。此外,在秦皮素浓度≥16μg/m L时,能显著抑制嗜水气单胞菌生长(P<0.05),并且对嗜水气单胞菌的抑制效果与秦皮素浓度呈正相关。而在非抑菌浓度下,对嗜水气单胞菌的运动能力和的溶血能力无显著影响(2~8μg/m L,P>0.05),但对嗜水气单胞菌的脂肪酶活性(8μg/m L)和蛋白酶活性(2~8μg/m L)有显著抑制作用(P<0.05)。2.细胞毒性研究显示:秦皮素作用CIK细胞2 h时,秦皮素(1μg/m L~256μg/m L)对CIK细胞活性无显著性影响(P>0.05);作用时间延长至24 h时,秦皮素浓度≥32μg/m L会对细胞活性产生显著影响(P<0.05),其IC50为83.22μg/m L;当作用时间进一步延长至48 h时,秦皮素浓度≥16μg/m L即会对细胞活性产生显著影响(P<0.05),其IC50为59.72μg/m L。3.鱼体试验结果表明,试验腹腔注射的秦皮素能提高团头鲂存活率。秦皮素浓度在16μg/g和4μg/g时,对鱼体保护效果较好。秦皮素(64?g/g、16?g/g和4?g/g)对鱼体血浆GLU含量无明显影响(P>0.05),但能显著降低其血浆TG和补体C3含量(P<0.05);秦皮素(64?g/g和4?g/g)能显著降低嗜水气单胞菌感染引起的血液TC、TP和ALB含量升高(P<0.05)。秦皮素给药(64?g/g、16?g/g和4?g/g)能明显提高感染引起的血液ALP活性降低(P<0.05),以及降低感染引起的AST活性升高(P<0.05)。与抗生素治疗方案相比,秦皮素给药(64?g/g、16?g/g和4?g/g)后能明显降低LDH活性(P<0.05),仅在秦皮素浓度为64?g/g时观察到ALT活性升高的现象(P<0.05)。肝脏抗氧化能力指标结果为:嗜水气单胞菌感染使团头鲂肝脏T-SOD活力明显下降(P<0.05);秦皮素在低浓度处理(16?g/g和4?g/g)时,能缓解T-SOD活力的降低,效果与抗生素处理相当,但在高浓度(64?g/g)时,T-SOD活力出现了进一步降低的现象(P<0.05)。秦皮素给药(64?g/g、16?g/g和4?g/g)时,能显著提高由于感染造成的CAT活力降低(P<0.05),其效果明显优于抗生素处理。抗生素和秦皮素处理均不能显著改善感染所致的GSH含量降低(P>0.05),秦皮素浓度为16?g/g时,效果比抗生素处理稍差(P<0.05)。秦皮素给药(16?g/g和4?g/g)时,团头鲂肝脏MDA含量均显著下降(P<0.05),其抗脂质过氧化的能力比抗生素更好。组织基因表达结果为:秦皮素给药(64?g/g和16?g/g)时,能显著性下调感染嗜水气单胞菌后鱼体肝脏组织中Nrf2、Keap1、SOD和GSH-Px表达(P<0.05),显著下调其CAT表达量(P<0.05)。感染组的脾脏Nrf2、Keap1、GSH-Px、CAT和SOD表达量均显著性上调(P<0.05),而在进行药物治疗后(秦皮素64?g/g、16?g/g、4?g/g和恩诺沙星20?g/g),脾脏中Nrf2、Keap1、GSH-Px、CAT和SOD表达量均显著性下调(P<0.05)。在秦皮素给药(64?g/g)时,显著性下调被感染鱼体肾脏中Keap1和CAT表达(P<0.05)。
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