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背景和目的:血管内血栓形成是引起心肌梗塞、缺血性卒中、系统性栓塞、肺栓塞以及静脉血栓等多种疾病的共同机制,也是目前导致病人发病与死亡的主要原因。治疗血栓、恢复血供至关重要。与介入性溶栓方法相比,以组织型纤溶酶原激活物(tPA)为代表的药物溶栓简便易行、创伤性低,是目前临床非常期待的治疗手段,但是其疗效尚不能令人满意,而且昂贵的价格和出血性并发症也制约着药物溶栓的临床应用。超声波及超声造影剂不仅在诊断领域、而且在治疗领域都得到了巨大的发展。国内外大量实验证明超声及声学造影剂具有明显的溶栓和助溶作用,其可能机理为:超声空化效应一方面可拉长、切断或损坏血栓中的纤维,增加溶栓药与血栓的结合位点,另一方面气泡破裂时产生的冲击波、微射流作为一种驱动力量,促使溶栓药向血栓内渗透,加快其结合速度,进而加速溶解。超声造影剂微泡的引入能增加空化核的数目,降低超声的空化阈值,明显提高空化效应的强度,并能增强药物的渗透作用。靶向微泡的研究使微泡能通过靶向配体与靶组织特异性结合,于局部聚集形成较高浓度,达到靶向显影或治疗的目的。目前研究证明使用能与激活血小板表面的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体特异结合的配体分子制备靶向微泡,可以和血栓特异性结合。本科室前期也已成功制备携带RGDS短肽配体的脂质体微泡造影剂,并在体外实验中证实其能与血栓特异性结合,而且在超声波辐照下能显著提高溶栓率。以超声激发击破携带药物或基因的造影剂微泡定点释放是一种新型无创的药物释放及基因转移的方法,该方法可将药物包载于造影剂微泡中防止药物在体循环中降解失活,在增加药物疗效的同时又可减小其副作用。本科实验室已成功制备出包载紫杉醇的脂质微泡造影剂。那么,如果能将微泡载药技术、靶向结合作用和空化效应促溶作用三者有机结合在一起,将为解决药物溶栓所面临的问题提供一条新的可行之路。本研究拟制备一种包载组织型纤溶酶原激活物(tPA)并同时携带RGDS短肽靶向配体的脂质体微泡造影剂,检测其体内外溶栓能力,并对其溶栓机理进行初步探讨。方法:1.采用冷冻干燥法和桥连剂共价键结合法制备载tPA携RGDS的脂质体微泡造影剂;光镜和荧光显微镜下观察其形态和大小以及tPA和RGDS在微泡上的定位情况,分别以Coulter颗粒计数仪、Zetasizer3000和pH计检测微泡的粒度粒径、表面电位和pH值。应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测tPA的包封率和载药量;应用流式细胞仪检测微泡上RGDS携带率;采用琼脂糖纤维蛋白平板法检测该微泡的促纤溶活性;以该微泡造影剂对兔肝脏实质造影并以时间-强度曲线(Time-intensity curve, TIC)评价其增强显影功能。2.制备体外人全血血栓;以不同频率(0.5MHz、1MHz和2MHz)和不同强度(0.7W/cm2、1.4W/cm2和1.8W/cm2)的脉冲超声波辐照溶栓,比较其溶栓率,并检测超声溶栓效果与超声频率及强度之间的相关性;建立以蠕动泵为动力源的体外循环模型;以占空比95 %、声强1.8W/cm2、频率2MHz的脉冲超声波辐照不同凝龄的血栓(2、6、12、24、48和72h),并给予凝龄2h的血栓不同时间的超声辐照(10、20、30和60min),比较溶栓率,评价超声溶栓率与血栓凝龄和辐照时间之间的相关性,并确定本研究超声体外溶栓条件;以不同剂量tPA溶栓(0.5、1、2、3、4和5μg/ml),比较溶栓率,确定体外溶栓实验tPA用量;分组以不同方法溶栓(对照、单纯超声辐照、单纯tPA、单纯载tPA携RGDS微泡、tPA+超声、普通微泡+超声、载tPA非靶向微泡+超声、普通微泡+tPA+超声及载tPA携RGDS微泡+超声),比较其溶栓率;对溶栓处理后的血栓块进行HE染色后光镜下做病理检查;以5FAM标记tPA,冰冻切片后荧光显微镜检查探讨超声辐照载tPA携RGDS脂质微泡的溶栓机理。3.以钳夹法制作兔股动脉血栓模型;比较声学造影、彩色多普勒血流显像(CDFI)、能量多普勒显像(PDI)和灰阶血流显像技术(B-flow)对兔股动脉血流的评价情况;以不同方法溶栓(对照、单纯治疗超声、单纯tPA、tPA+治疗超声、tPA+普通微泡+治疗超声、载tPA携RGDS微泡+治疗超声、载tPA携RGDS微泡+诊断超声),以B-flow观察并比较兔股动脉再通情况和再通出现时间;测量并比较溶栓前后股动脉局部体温;以ELISA法测量并比较溶栓前后兔血液D-二聚体(D-D)水平。结果:1.成功制备载tPA携RGDS脂质微泡造影剂,平均粒径为2.08μm(0.6~4.7μm),表面电位-51.3,pH值5.58,载药量为(0.59±0.02)mg/ml,包封率为(81.12±2.44)%,RGDS短肽配体的携带率为(94.49±6.19)%,超声辐照后的造影剂溶液具有一定的溶栓活性,该造影剂能明显持续增强肝脏回声,TIC参数中峰值强度(Peak intensity,PT)为86.54±5.09,达峰时间(Time to peak,PT)为(46±8.94)s,平均渡越时间(Mean transit time,MTT)为(690±61.64)s。2.以三种频率、三种能量超声辐照体外血栓,溶栓率均高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);固定频率为2MHz条件下,溶栓率与超声强度成正相关(r1 = 1.000, P<0.01);固定声强1.8W/cm2条件下,溶栓率与超声频率成负相关(r2 = -1.000, P<0.01);以不同剂量tPA于体外溶栓,随着tPA浓度的升高,溶栓率也有升高的趋势,但组别之间差异无显著意义(P >0.05);成功建立以蠕动泵为动力源的体外循环模型;以占空比95%,声强1.8W/cm2,频率2MHz的脉冲超声波辐照不同凝龄的血栓,凝龄12h以内,超声辐照后的溶栓率明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05),超声波溶栓率与血栓凝龄成反比(r1 = -1.000,P<0.01);不同辐照时间条件下,超声体外溶栓率都明显升高,差异有显著性意义(P<0.01),超声波溶栓率与辐照时间成正比(r2 = 1.000,P<0.01);我们选择频率为2MHz、声强为1.8W/cm2的脉冲超声为本实验体内外超声溶栓条件,凝龄为2h的血栓,辐照时间为10min,tPA用量为1μg/ml;体外溶栓实验结果为,除单纯tPA-tMB组外,其余各组溶栓率均高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05),单纯超声组与单纯tPA组之间无显著差异(P>0.05),但均小于tPA+超声组、普通微泡+超声组和载tPA非靶向微泡+超声组(P<0.05),后三者之间无显著差异(P>0.05),普通微泡+tPA+超声组与载tPA携RGDS微泡+超声组溶栓率最高(P<0.05),而两者之间无显著差异(P>0.05);病理检查可见,辐照血栓内可见“空洞样”结构,以普通微泡+tPA+超声组和载tPA携RGDS微泡+超声组最为明显;冰冻切片后荧光显微镜检查可见,无超声辐照的载tPA携RGDS脂质微泡黏附于血栓边缘,形成明亮的红色荧光带,超声辐照载tPA携RGDS脂质微泡后,血栓内部可见大量荧光分布。3.以钳夹法成功建立兔股动脉血栓模型;以ATL5000和LOGIQ7超声诊断仪及自制脂质微泡造影剂脂氟显对兔股动脉造影,难以客观评价兔股动脉血流,CDFI和PDI易产生充盈缺损和溢出伪像,B-flow技术能客观显示兔股动脉血流,分辩率高,无伪像,操作简便;各溶栓方法体内溶栓后再通率差异有显著性意义(χ2= 20.00, P<0.01),联合使用tPA、普通脂质体造影剂和超声辐照与联合使用载tPA携RGDS靶向脂质体造影剂和超声辐照所得到的再通率最高(80%和70%),但二者之间的差异无显著性意义(χ2= 0.27, P = 0.61),联合使用诊断超声辐照和载tPA携RGDS脂质微泡所得再通率与对照组比较,差异无显著意义(χ2= 0.39, P= 0.50);联合使用tPA、普通脂质体造影剂和超声辐照三者再通出现时间主要集中于前20min,联合使用载tPA携RGDS靶向脂质体造影剂和超声辐照再通出现时间主要集中于后20min,差异有显著性意义(χ2= 6.83, P<0.05);各溶栓方法治疗前后,股动脉局部体温升高低于2℃,最高体温低于40℃;各溶栓方法治疗前后D-D水平都有显著升高(P<0.05),单纯使用tPA、联合使用tPA和超声辐照、联合使用tPA、空白微泡和超声辐照以及联合使用载tPA携RGDS靶向脂质体造影剂和超声辐照显著高于对照组和单纯使用超声组(P<0.01),但这四种方法中,联合使用载tPA携RGDS靶向脂质体造影剂和超声辐照治疗后的D-D水平却明显低于前三者(P<0.01)。结论:1.成功制备载tPA携RGDS脂质微泡造影剂,粒径符合注射要求,包封率及配体携带率较高,并具有增强显影功能,超声辐照后具有一定的溶栓活性。2.体外超声溶栓效果与超声频率、血栓凝龄成反比,与超声强度、辐照时间成正比。3.超声辐照载tPA携RGDS脂质微泡造影剂在体外能显著提高溶栓率。其可能机理为:载tPA微泡通过RGDS靶向配体与血栓特异性结合后于局部聚集,超声辐照产生的空化效应使微泡破裂释放药物,并促进药物溶栓作用。4.超声辐照载tPA携RGDS脂质微泡造影剂在体内可达到良好的溶栓效果,而且不会对局部组织产生热损伤,所产生的纤溶产物也低于系统性应用tPA或超声及微泡辅助tPA溶栓方法。