白介素-32(IL-32)最早发现于1992年,是NK细胞、上皮细胞所分泌的一种细胞因子,但此后对于其研究并未取得明显进展,直到2005年才被正式命名为IL-32,是目前发现的最新的细胞因子之一。目前的研究表明IL-32在免疫缺陷症、溃疡性结肠炎、克罗恩、类风湿等疾病均有异常表达,在呼吸系统疾病,IL-32在肺结核、肺癌、哮喘及慢性阻塞性肺疾病(COPD)也均有异常表达。研究证明人体内存在γ-干扰素(INF-γ)——IL-32——白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)正反馈通路,COPD患者尤其慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)患者,该通路被激活,IL-32表达明显增加;国内外研究表明,硝苯地平、辛伐他汀、布地奈德等药物能抑制哮喘中的IL-32的表达,从而发挥抗炎作用,减轻哮喘急性发作的次数及严重程度,国外研究还表明布地奈德也能抑制COPD中IL-32表达。国内外的研究认为IL-32主要通过丝裂原活化蛋白激酶P38(P38MAPK)磷酸化途径、核因子-?b(NF-?b)途径、Caspase途径等激活下游新号通路,上调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、白介素-8(IL-8),白介素-6(IL-6)等炎症因子的表达,参与了COPD的炎症反应,目前研究证实INF-γ——IL-32——IL-1β通过调节TGF-β、VEGF等的表达参与COPD的气道重塑过程及肺气肿的形成。糖皮质激素(GC)因为其广泛的有效的的抗炎作用,是治疗COPD最主要的药物,但其疗效远不如哮喘,目前认为导致这一结果原因是糖皮质激素抵抗,早期的研究认为糖皮质激素抵抗的主要原因是GR异常所致,大量资料表明糖皮质激素抵抗患者及动物模型均检测到糖皮质激素受体(GR)表达降低。而最新研究表明人体GR受体存在α、β两种亚型,GRα是发挥糖皮质激素效应的靶受体,而GRβ则是一种糖皮质激素效应的内源性拮抗剂,在激素抵抗型的哮喘及血液病的患者中,检测到GRα表达下调、GRβ表达上调,因此GRα/GRβ失衡是糖皮质激素抵抗的重要原因。少数研究表明INF-γ——IL-32——IL-1β通过NF-?b/AP-1通路参与GRα、GRβ等表达,通过上调GRβ表达,下调GRα表达,参与了糖皮质激素抵抗。克拉霉素是一种大环内酯类药物,已经被广泛用于稳定期COPD的治疗,研究表明:克拉霉素可以降低稳定期COPD患者TNF-α,IL-8,IL-6等炎症因子的表达,抑制肺部炎症,提高运动耐力,改善肺功能。克拉霉素的在COPD中抗炎作用已经被公认,但是关于克拉霉素治疗COPD中的机制,国内外研究虽然较少,克拉霉素是否通过INF-γ——IL-32——IL-1β通路调节下游炎症因子的表达,从而发挥治疗COPD作用,克拉霉素是否通过INF-γ——IL-32——IL-1β调节NF-?b/AP-1,影响GRα、GRβ的表达,从而逆转糖皮质激素抵抗,国内外尚未见类似研究,本研究意在探克拉霉素下调IL-32表达对COPD大鼠糖皮质激素抵抗的影响及机制。材料与方法健康的雄性SD大鼠50只,体重180±20g。随机分为:空白组(10只)、模型组(40只)。模型组:第1、31、61天经气管插管后气道内滴入脂多糖,第2~30、32~60、62~90天在熏烟箱中被动吸烟。健康对照组:第1、31、61天经气管插管后气道内滴入生理盐水,第2~30、32~60、62~90天在熏烟箱中呼吸空气。模型构建完成后,将模型组随机分为4组,即COPD组,克拉霉素中,布地奈德组,联合干预组,每组10只。COPD组:第91天开始给予生理盐水灌胃,1次/日,2ml/只,共30天。克拉霉素组:第91天开始给予克拉霉素灌胃,1次/日,50mg/kg,共30天。布地奈德组:第91天开始雾化吸入布地奈德,1次/日,1mg/只,共30天。联合干预组:第91天开始给予克拉霉素灌胃,剂量及时间同上,雾化吸入布地奈德,剂量及时间同上。第121天检测肺功能,留取血液及肺泡灌洗液,使用ELISA法检测血清及肺泡灌洗液中INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平;部分肺组织进行HE染色后观察肺组织病理学改变,部分肺组织使用免疫组化、Western Blot及RT-PCR检测GRα及GRβ的表达。统计学分析:所有数据均采用SPSS17.0统计学软件进行分析。以均数±标准差(sx?)描述数据,两组间比较采用t检验,多组间比较采用采用单因素方差分析,相关性分析采用Pearson相关。显著性检验水准α=0.05。结果1各组大鼠肺组织病理学改变与空白组相比,COPD组大鼠气管及支气管粘膜上皮细胞脱落,炎性细胞浸润,支气管平滑肌增厚,胶原沉积,肺泡壁变薄,甚至破裂融合成肺大泡。与COPD患者的气管及肺组织病理学变化一致。各药物干预组的大鼠肺组织破坏程度都较COPD组轻,其中联合干预组大鼠肺组织破坏最轻。2各组大鼠肺功能改变COPD组大鼠,0.3秒最大呼气量/用力肺活量(forced expiratory volume0.3/forced vital capacity,FEV0.3/FVC)明显低于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05);吸气阻力(inspiratory resistance,Ri)、呼气阻力(expiratory resistance,Re)明显高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。克拉霉素组、布地奈德组FEV0.3/FVC均高于COPD组,且差异具有统计学意义(P<0.05);克拉霉素组、布地奈德组Ri及Re明显低于COPD组,差异具有统计学意义(P<0.05)。联合干预组FEV0.3/FVC高于COPD组、克拉霉素组及布地奈德组,差异具有统计学意义,联合干预组Ri、Re低于COPD组、克拉霉素组及布地奈德组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3血清及肺泡灌洗液中INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平COPD组血清INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明显高于空白组,且差异均具有统计学意义(P<0.05);COPD组肺泡灌洗液INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明显高于空白组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。布地奈德组及克拉霉素组血清INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明显低于COPD组,且差异均具有统计学意义(P<0.05);布地奈德组及克拉霉素组肺泡灌洗液明显低于COPD,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。联合干预组血清INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明显低于COPD组、布地奈德组、克拉霉素组,且差异均具有统计学意义(P<0.05),联合干预组肺泡灌洗液INF-γ、IL-32、TNF-α、NF-?b的水平明显低于COPD组、布地奈德组、克拉霉素组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。4肺组织中GRα、GRβ的免疫组化COPD组GRα表达为明显低于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05);GRβ表达明显高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。布地奈德组、克拉霉素组GRα表达均高于COPD组,差异均具有统计学意义(P<0.05);GRβ表达均低于COPD组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。联合干预组GRα表达高于COPD组、布地奈德组、克拉霉素组,差异均有统计学意义(P<0.05);GRβ表达低于COPD组、布地奈德组、克拉霉素组,差异均有统计学意义(P<0.05)。5肺组织中GRα、GRβ蛋白表达水平COPD组GRα蛋白表达水明显低于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05);GRβ蛋白表达水平明显高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。布地奈德组、克拉霉素组GRα蛋白表达水平均高于COPD组,差异均具有统计学意义(P<0.05);GRβ蛋白表达水平均低于COPD组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。联合干预组GRα蛋白表达水平高于COPD组、布地奈德组、克拉霉素组,差异均有统计学意义(P<0.05);GRβ蛋白表达水平低于COPD组、布地奈德组、克拉霉素组,差异均有统计学意义(P<0.05)。6肺组织中GRα、GRβ的m RNA水平COPD组GRαmRNA水平明显低于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05);GRβm RNA水平明显高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。布地奈德组、克拉霉素组GRαm RNA水平均高于COPD组,差异均具有统计学意义(P<0.05);GRβ表达均低于COPD组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。联合干预组GRαm RNA水平高于COPD组、布地奈德组、克拉霉素组,差异均有统计学意义(P<0.05);GRβ表达低于COPD组、布地奈德组、克拉霉素组,差异均有统计学意义(P<0.05)。7血清(B)及肺泡灌洗液中(F)INF-γ、IL-32与TNF-α、NF-kb、FEV0.3/FVC、GRα、GRβ相关性分析大鼠血清及肺泡灌洗液中INF-γ与IL-32均呈正相关(P<0.05);大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-32与TNF-α、NF-?b均呈正相关(P<0.05),与FEV0.3/FVC呈负相关(P<0.05)。大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-32、TNF-α、NF-?b与肺组织中GRα免疫组化、蛋白表达水平、m RNA水平均呈负相关(P<0.05),与GRβ免疫组化、蛋白表达水平、m RNA均呈正相关(P<0.05)。结论1.INF-γ——IL-32——IL-1β正反馈环参与了COPD的发病过程,克拉霉素、布地奈德单用或联合应用均能不同程度抑制该反馈环激活,减轻COPD大鼠肺部及全身的炎症反应,改善COPD大鼠肺功能。2.COPD大鼠GRα表达明显降低,GRβ表达明显升高,GRα/GRβ失衡导致COPD大鼠产生糖皮质激素抵抗。3.克拉霉素、布地奈德均在不同程度上调节GRα/GRβ失衡,逆转COPD大鼠糖皮质激素抵抗,两者联合应用时效果更明显,这一过程于INF-γ——IL-32——IL-1β正反馈环有关。