【摘 要】
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纤维素酶广泛存在于生物体内,是一种绿色高效的生物催化剂。然而由于该酶生产成本高且在极端条件下易失活,严重限制了其在工业中的广泛应用。目前,水作为酶的催化反应介质主要存在催化效率低以及长时间催化时酶不稳定的问题,同时分离纯化酶常用的色谱技术存在操作复杂、耗时长及成本高等问题。因此,寻找一种既可作为良好催化介质,又能对酶实现分离纯化的溶剂成为目前极有意义的一项研究工作。离子液体（ILs）和低共熔溶剂（
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纤维素酶广泛存在于生物体内,是一种绿色高效的生物催化剂。然而由于该酶生产成本高且在极端条件下易失活,严重限制了其在工业中的广泛应用。目前,水作为酶的催化反应介质主要存在催化效率低以及长时间催化时酶不稳定的问题,同时分离纯化酶常用的色谱技术存在操作复杂、耗时长及成本高等问题。因此,寻找一种既可作为良好催化介质,又能对酶实现分离纯化的溶剂成为目前极有意义的一项研究工作。离子液体（ILs）和低共熔溶剂（DESs）作为极具应用价值的绿色溶剂为该类研究提供了新思路。基于此,本实验一方面通过开展纤维素酶在ILs/DESs中稳定性的影响因素和机理研究,分析ILs和DESs作为酶催化介质的可行性。另一方面构建合适的胆碱类ILs/DESs+盐双水相体系,实现对发酵液中带有胆碱结合蛋白LytA标签的β-葡萄糖苷酶（GLytA）的分离纯化。具体研究内容如下:（1）讨论了纤维素酶在ILs/DESs中的稳定性。以氯化胆碱（Ch Cl）、甜菜碱（Bet）为氢键受体,乙二醇（EG）、甘油（Gly）为氢键供体,按1:2摩尔比制备Ch Cl-Gly、Ch Cl-EG、Bet-Gly和Bet-EG四种DESs,并通过FT-IR对其结构进行表征;分析并讨论乳酸胆碱（[Ch][Lac]）、醋酸胆碱（[Ch][Ac]）两种商品化ILs及制备的四种DESs粘度,可知ILs/DESs的粘度随浓度的降低和温度的升高而降低;深入研究ILs/DESs种类、浓度、温度及孵育时间对纤维素酶稳定性影响及相关动力学研究,确定纤维素酶在50℃、30%ILs/DESs中的稳定性顺序为:[Ch][Lac]>[Ch][Ac]>Bet-EG>Ch Cl-EG>Bet-Gly>Ch Cl-Gly;利用荧光光谱分析证明DESs能为酶提供更疏水的环境,有利于纤维素酶的稳定性。圆二色谱分析表明ILs/DESs对纤维素酶结构无破坏作用。（2）本实验构建了胆碱类离子液体/低共熔溶剂+盐双水相体系,并应用该体系分离纯化重组β-葡萄糖苷酶。首先,设计并构建了含有胆碱结合蛋白LytA标签的β-葡萄糖苷酶重组质粒p ET-Glu-Linker-GLytA,通过对其进行双酶切验证了该重组质粒的正确性,之后在大肠杆菌中进行诱导表达,最终确定重组酶GLytA的最佳诱导表达条件为:诱导剂IPTG浓度0.2 m M,诱导温度25℃,诱导时间12 h。接着,构建胆碱类双水相体系ILs/DESs+K2HPO4 ATPS,并测定了ATPS的双节线和系线数据,进一步分析温度、ILs和DESs种类对其分相能力的影响,结果表明Bet-Gly对温度最为敏感,其分相能力随温度的升高下降明显,其次是Ch Cl-Gly和Bet-EG,而两种ILs和Ch Cl-EG对温度的敏感性较弱。最后,利用重组酶GLytA上胆碱结合标签的亲和作用,通过讨论双水相体系中DESs种类、上下相质量分数、温度及萃取时间对重组酶GLytA的萃取效率及分配系数的影响,选取合适的双水相体系,并对重组酶GLytA进行一步分离纯化。在最佳23.11%Bet-EG+40.50%K2HPO4 ATPS条件下,酶活回收率和纯化因子分别达到89.07%和8.3359。利用DES富集相中的重组酶GLytA与纤维素酶比值为0.5时对微晶纤维素进行协同催化,48 h后糖化率可达到81.20%,比仅用纯纤维素酶催化（水中）提高了22.4%。该混合酶液在4℃下保存35天后仍有64.22%的残留活性,具有很好的贮藏稳定性。
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