【摘 要】
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第一部分Sidt2基因全身敲除小鼠胰岛素分泌障碍的机制研究目的:研究Sidt2蛋白在小鼠胰腺胰岛的表达与定位,进一步探讨Sidt2基因缺陷小鼠胰岛素分泌障碍的可能机制。对象和方法:通过qRCR、Western blotting和免疫荧光方法检测Sidt2蛋白在野生小鼠、Sidt2基因敲除(Sidt2-/-)小鼠胰岛及INS-1细胞株的表达及定位情况。检测野生及Sidt2-/-胰岛β细胞在高剂量葡萄
【基金项目】
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国家自然科学基金（项目编号:30971386）； 上海市科学技术委员会启明星后计划（项目编号:12QH1401800）；
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第一部分Sidt2基因全身敲除小鼠胰岛素分泌障碍的机制研究目的:研究Sidt2蛋白在小鼠胰腺胰岛的表达与定位,进一步探讨Sidt2基因缺陷小鼠胰岛素分泌障碍的可能机制。对象和方法:通过qRCR、Western blotting和免疫荧光方法检测Sidt2蛋白在野生小鼠、Sidt2基因敲除(Sidt2-/-)小鼠胰岛及INS-1细胞株的表达及定位情况。检测野生及Sidt2-/-胰岛β细胞在高剂量葡萄糖刺激下胰岛素分泌通路中各指标的变化:NADPH（荧光测定和酶循环方法）,KATP、KV2.1电流及胞内游离钙离子浓度（膜片钳,Fura-2/AM探针）,膜电位和胰岛素分泌颗粒pH（激光共聚焦,Lysosensor DND-189）;流式检测野生及Sidt2-/-小鼠原代培养成纤维细胞溶酶体pH。结果:Sidt2在野生小鼠胰腺β细胞及INS-1细胞株表达,并定位于胰岛素分泌颗粒亚细胞器上。高剂量葡萄糖刺激下,Sidt2-/-小鼠胰岛β细胞NADPH变化、KATP和KV2.1电流和膜电位指标正常,而钙离子信号反应受损（增幅较低、反应时间延迟）。在胞外零钙外液情况下,野生组[Ca2+]i对高剂量葡萄糖反应减弱,Sidt2-/-组β细胞基本无反应。用内质网钙泵阻断剂2-APB或ryanodine干预后,两组峰值均降低,Sidt2-/-组[Ca2+]i峰值仍低于野生组,但两组降低幅度一致。用H+-ATP酶Bafilomycin A1干预可引起两组细胞[Ca2+]i升高,进一步用20 mM葡萄糖刺激两组细胞Ca2+反应一致,提示Sidt2-/-胰岛β细胞酸性细胞器钙离子反应受损。另外,两组成纤维细胞溶酶体及胰岛β细胞胰岛素分泌颗粒pH正常。在酸性细胞器第二信使NAADP孵育条件下Sidt2-/-胰岛β细胞Ca2+对高剂量葡萄糖反应正常。CD38检测显示高剂量葡萄糖刺激下野生及Sidt2-/-胰岛CD38表达量均增高,两组无统计学差异。结论:Sidt2基因缺陷导致胰岛β细胞NAADP信号不足,酸性细胞器钙库释放障碍,最终导致胞内Ca2+信号受损。Sidt2蛋白参与了胰岛β细胞胞内NAADP信号的调控,其可能作为酸性细胞器NAADP转运通道。第二部分骨骼肌特异性敲除Sidt2小鼠骨骼肌的影响研究目的:探讨Sidt2基因敲除导致骨骼肌病变与糖代谢异常的病理生理关系。分析骨骼肌特异性Sidt2敲除对骨骼肌表达谱的影响,寻找差异性表达基因及通路分析,以期从靶基因的角度揭示Sidt2基因缺陷致骨骼肌病变的分子机制。对象和方法:利用骨骼肌特异性表达Cre重组酶小鼠模型与已有Sidt2f lox/flox或Sidt2f lox/-小鼠交配繁殖建立骨骼肌特异性敲除Sidt2小鼠模型;转棒实验评定模型小鼠肌力受损情况,HE染色和电镜观察骨骼肌病理和超微结构改变;空腹血糖测定和糖耐量实验检测模型小鼠糖代谢情况。并进一步利用小鼠表达谱芯片Mouse Gene ST 2.0 Array,分析骨骼肌特异性Sidt2基因敲除对骨骼肌表达谱的影响。结果:骨骼肌特异性Sidt2敲除小鼠8w即出现四肢肌力明显受损和病理改变,且随着年龄增加病变加重。追踪至6个月龄模型小鼠空腹血糖及糖耐量均正常。基因表达谱芯片分析共发现显著性表达差异基因共590条（上调432,下调158）。对差异基因进一步进行通路分析共发现183条信号通路变化显著（上调130,下调53）。上调通路主要包括:吞噬、溶酶体和肌动蛋白调控等;下调通路主要涉及代谢通路和钙离子信号通路。结论:Sidt2基因敲除可直接导致骨骼肌病变,观察至6个月龄模型小鼠尚未发生糖代谢异常。钙离子信号通路可能亦是骨骼肌病变的致病原因。
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