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目的:阐明蜕膜巨噬细胞表面Tim-3在孕期弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制。方法:体外实验:取人早孕期流产蜕膜组织标本,分离蜕膜组织,制备单细胞悬液,磁珠分选纯化获得人蜕膜巨噬细胞,将其平均分为正常组、感染组和Tim-3抗体中和感染组,其中,感染组和Tim-3抗体中和感染组加入刚地弓形虫RH株速殖子(细胞数:虫子数=1:2)感染24h。流式细胞术检测各组蜕膜巨噬细胞表面Tim-3的表达水平、M1型功能分子(膜功能分子CD80、CD86,胞内TNF-α)、M2型功能分子(膜功能分子CD163、CD209、CD206,胞内IL-10)的表达水平。Western Blot技术检测各组蜕膜巨噬细胞中精氨酸代谢酶iNOS和Arg-I的合成水平。ELISA方法检测各组人蜕膜巨噬细胞培养上清中TNF-α和IL-10的水平。体内实验:建立弓形虫感染致不良妊娠结局的C57BL/6野生型和Tim-3基因敲除(Tim-3-/-)的孕鼠模型,以未感染组孕鼠作为正常对照组,分为正常组、感染组和Tim-3-/-感染组,感染组和Tim-3-/-感染组分别于孕8天腹腔感染刚地弓形虫RH株速殖子400条。于孕14天观察并记录各组孕鼠妊娠结局,包括孕鼠精神状态,活胎数、死胎数吸和收胎数,胎鼠及胎盘重量,及其出血情况。将剥离的胎盘与子宫制备单细胞悬液,流式细胞术分别检测各组蜕膜巨噬细胞表面Tim-3、M1型功能分子(膜功能分子CD80、CD86,精氨酸代谢酶iNOS,胞内TNF-α)、M2型功能分子(膜功能分子CD206,精氨酸代谢酶Arg-I,胞内IL-10)的表达水平。结果:体外实验:流式检测结果显示,感染组人蜕膜巨噬细胞表面Tim-3表达水平较正常组明显降低。流式结果显示,感染组人蜕膜巨噬细胞表面M1型膜功能分子CD80、CD86表达水平较正常组明显升高,而M2型膜功能分子CD163,CD209,CD206的表达水平明显降低(P<0.05)。Western Blot结果显示,感染组人蜕膜巨噬细胞内M1型精氨酸代谢酶iNOS表达明显升高,而M2型精氨酸代谢酶Arg-I表达明显降低(p<0.05)。流式和ELISA检测结果显示,感染组人蜕膜巨噬细胞胞内及培养上清中TNF-α、IL-10的水平较正常组均升高,但TNF-α升高更为明显,二者比值TNF-α/IL-10较正常组明显升高(P＜0.05)。为验证蜕膜巨噬细胞表面Tim-3对以上功能分子的影响,在Tim-3抗体中和感染组中对以上功能分子进行进一步检测。流式检测结果显示,与感染组相比,Tim-3抗体中和感染组M1型膜功能分子CD80、CD86表达水平明显升高,而M2型膜功能分子CD163、CD209、CD206表达水平明显降低(p＜ 0.05),Tim-3仍能检测到少量表达。Western Blot结果显示,人蜕膜巨噬细胞内M1型精氨酸代谢酶iNOS表达明显升高,而M2型精氨酸代谢酶Arg-I表达明显降低(p<0.05)。流式检测结果显示,蜕膜巨噬细胞胞内TNF-α、IL-10的表达水平均降低,IL-10降低更为明显,二者比值TNF-α/IL-10较感染组明显升高(p＜ 0.05)。ELISA检测结果显示,蜕膜巨噬细胞胞培养上清中TNF-α IL-10的分泌水平均升高,TNF-α升高更为明显,二者比值TNF-α/IL-10明显升高(p<0.05)。体内实验:与正常组比,感染组弓形虫感染后出现明显不良妊娠结局,孕鼠出现萎靡不振,弓背,活动减少,胎鼠中活胎数明显减少,胎鼠体积减小,重量减轻,有明显的吸收胎和死胎,胎盘体积减小及其重量减轻,且胎盘四周有明显出血。而Tim-3-/-感染组较感染组呈现更为严重的不良妊娠结局,孕鼠精神状态更加萎靡,弓背、耸毛更加严重,胎鼠中出现更多的吸收胎和死胎,有的胎鼠甚至不成形,胎盘体积进一步减小,重量进一步减轻,出血更为严重。流式结果显示,与正常组相比,感染组孕鼠蜕膜巨噬细胞表面Tim-3表达水平明显降低,蜕膜巨噬细胞表面M1型膜功能分子CD80、CD86表达水平明显升高,M2型膜功能分子CD206的表达明显降低(p＜ 0.05):蜕膜巨噬细胞内iNOS的表达水平较正常组明显升高,而Arg-I则明显降低,且Tim-3的表达水平与iNOS呈明显负相关,与Arg-I呈明显正相关(p＜ 0.05);蜕膜巨噬细胞胞内TNF-α的水平明显升高,而IL-10的分泌则有所降低(p＜0.05),二者比值TNF-α/IL-10明显升高(p<0.05)。为进一步探索弓形虫感染所致以上功能分子的改变是否由Tim-3表达水平降低所引起,将Tim-3-/-感染组与感染组进行比较,结果显示,M1型膜功能分子CD80、CD86较感染组明显升高,M2型膜功能分子CD206明显降低(p<0.05);蜕膜巨噬细胞内合成iNOS水平较感染组明显升高,而Arg-I的水平则明显降低(p<0.05);蜕膜巨噬细胞胞内TNF-α的分泌水平较感染组明显升高,IL-10的分泌也有所升高,但二者比值TNF-α/IL-10较感染组明显升高(p<0.05)。结论:孕期弓形虫感染导致人和小鼠蜕膜巨噬细胞表面Tim-3表达水平明显下降,Tim-3表达水平下降进而可引起蜕膜巨噬细胞由M2型向M1型极化,M1型蜕膜巨噬细胞相关功能分子表达增加,对胚胎的杀伤功能增强;M2型蜕膜巨噬细胞相关功能分子表达均明显减少,母胎耐受功能减弱,这可能是孕期弓形虫感染致不良妊娠结局发生的重要分子免疫机制。本研究初步阐明了蜕膜巨噬细胞表面抑制性分子Tim-3在孕期弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制,本研究结果为全面阐明孕期弓形虫感染致不良妊娠结局的分子机制研究增添了新的内容,也必将为寻找并建立有效预防和治疗先天性弓形虫的手段和方法奠定理论基础,对从根本上降低出生缺陷、提高出生人口质量产生极其重要的意义。